目的 结直肠癌的发病率和死亡率逐年升高,均高居于恶性肿瘤的第三位,严重影响人类的生命健康。结直肠癌的发生是多因素、多基因、多步骤共同作用的过程。影像、内镜、肛门指检是目前诊断结直肠癌的主要途径,但仍有许多患者经历了疾病的误诊、误治,甚至错过了最佳治疗时机。基因的深入研究为探讨结直肠癌的发生、发展机理提供了新的思路。结直肠癌是基因表达异常和异常物质的进行性累积的结果,异常表达的基因就可能成为监测结直肠癌的生物学标志。基因检测技术的日益成熟为结直肠癌的早期诊断提供了便利。尽管一些肿瘤标志物被我们所发现并应用于临床,但这远远不够,结直肠癌的发生机制是很复杂的,我们需要从更多方面了解结直肠癌的发生机理,进一步达到早期诊断,早期治疗的目的。近年基因甲基化是肿瘤研究的热点,DNA甲基化是肿瘤发生的早期事件,指在DNA甲基化转移酶(DNMT)的作用下,将S-腺苷甲硫氨酸(SAM)提供的甲基基团共价结合到Cp G二核苷酸的胞嘧啶5’碳位(5m-c)上的过程。基因启动子区Cp G岛甲基化是一种序列不发生改变的基因表达沉默,属于表观遗传学改变,这个过程是可逆的,目的是保护特定DNA位点不受特定酶的降解以调节基因表达,使基因在特定时间和空间发挥作用,保证了基因表达的有效调控。基因启动子甲基化与转录密切相关,正常组织内同时存在高甲基化和低甲基化的状态,高甲基化会阻止基因的转录,而低甲基化会促进转录。抑癌基因和癌基因的异常甲基化会诱导肿瘤的形成。有学者研究发现,肿瘤患者体内甲基化水平普遍要比健康人高,机体处于微卫星不稳定状态基因更易发生改变,而某些基因甲基化水平是与年龄相关的,并随着年龄的增长随之增高。近年来关于用抑癌基因甲基化作为肿瘤检测指标的研究越来越多,异常甲基化发生在肿瘤形成的早期阶段,随着肿瘤的恶性进展,甲基化发生的概率越来越高,国内外报道中除了单独检测,也包括联合检测基因甲基化为结直肠癌的早期诊断提供了较为特异的诊断依据。PAQR3是孕酮和脂联素受体(PAQR)家族中的一员,是一种新的结直肠癌抑癌基因,参与细胞的信号转导、能量代谢、细胞分裂增殖、分化和生殖细胞的成熟等生物学过程。又名PKTG,可编码37 k D的膜蛋白,它是一个N端朝向胞质、C端朝向细胞器腔内、定位于高尔基体膜上的7次跨膜蛋白,能负性调Ras/Raf/MEK/ERK信号通路,后者是经典的丝裂原活化蛋白激酶级联信号途径(mitogen-activated proteinkinases cascade,MAPKs cascade)之一,是感受胞外信号、控制细胞增殖分化及存活的主要的一条信号通路,其作用是将细胞外刺激信号传递至胞内,达到调控细胞的增殖、分化、凋亡及细胞恶性转化、癌症的发生发展等生理过程的目的。此外,PAQR3可以通过两种机理来调控AKT信号通路,一方面,PAQR3结合并改变胞质中PI3K复合物的p110ɑ的亚细胞定位,阻止与p85调控位点的结合,导致PI3K的失活以及AKT的磷酸化;另一方面,PAQR3可以阻断GPCR的Gβ位点,抑制AKT在GRCR激活的Gβ/γ位点的作用。在胃癌组织中,PAQR3负性调控ERK和AKT的磷酸化,证明PAQR3通过抑制ERK和AKT的信号通路发挥负性调节EMT的过程的。本课题旨在从细胞分子水平上分析PAQR3 m RNA、DNA甲基化和蛋白表达水平,以及甲基化水平与结直肠癌的关系,为更有效的诊断和治疗结直肠癌提供新的靶点。方法 收集54例结直肠癌及相应的癌旁正常组织,q RT-PCR法用于分析PAQR3 m RNA水平;MSP法分析PAQR3基因甲基化水平;Western blot法检测PAQR3蛋白的表达水平。统计方法:应用SPSS16.0统计软件进行数据处理,计量资料采用均数±标准差(c±S)表示,计数资料采用Fisher’s确切概率法或卡方检验,以p<0.05为差异有统计学意义。结果 (1)54组标本中有31个结直肠癌组织中PAQR3 m RNA水平表达降低,表达降低率为57.4%(31/54),癌组织PAQR3 m RNA的Dct:9.32±1.97,癌旁正常组织Dct:8.44±2.42,差异有统计学意义(p<0.05)。(2)在31组PAQR3 m RNA表达降低的患者中,有12组结直肠癌组织中PAQR3基因发生部分甲基化,6组发生完全甲基化,13组未发生甲基化,相比于正常组织,癌组织中PAQR3发生高甲基化,在其余23组PAQR3表达未明显下降的结直肠癌患者中,有3个癌组织发生部分甲基化,20个癌组织未发生甲基化,差异有统计学意义(p<0.05)。结直肠癌组织中PAQR3甲基化率为33.3%(18/54),癌旁组织甲基化率为5.6%(3/54),PAQR3基因在结直肠癌组织中的甲基化率明显高于相应的癌旁正常组织(p<0.05)。(3)25例结直肠癌组织中PAQR3蛋白表达水平降低甚至不表达,癌组织中蛋白表达降低率为46.3%(25/54),癌旁组织中蛋白表达降低率为5.6%(3/54),差异有统计学意义(p<0.05)。(4)统计分析显示,PAQR3基因甲基化水平与年龄、分化程度、浸润深度、有无淋巴结转移有关,年龄越大、分化程度越低、淋巴结转移、浸润深的甲基化率越高;反之,越低。PAQR3基因甲基化水平与性别、肿瘤部位无关。癌旁正常组织PAQR3甲基化与性别、年龄、肿瘤部位、分化程度、淋巴结转移、浸润深度无关。结论 (1)结直肠癌组织中PAQR3 m RNA表达水平降低。(2)结直肠癌组织中PAQR3基因甲基化水平升高。(3)结直肠癌组织中PAQR3蛋白表达水平降低。(4)PAQR3基因启动子甲基化与结直肠癌的发生有关,年龄越大、分化程度越低,浸润越深,有淋巴结转移者,PAQR3基因甲基化水平越高;反之,越低。