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猪脑心肌炎是由脑心肌炎病毒(encephalomyomyocarditis virus,EMCV)引起的以仔猪脑炎、心肌炎和心肌周围炎为主要临床症状及母猪流产、产死胎、弱胎、木乃伊胎等繁殖障碍为主要临床症状的急性传染病。该病是一种人畜共患病,不仅给养猪业带来巨大的经济损失,也危害了人类的健康。EMCV 2C基因参与病毒基因组的复制,其表达产物2C蛋白具有良好的免疫原性。本文对EMCV TJ分离株的2C基因进行了克隆,构建了表达载体,获得了原核表达的2C蛋白,建立了检测EMCV抗体的ELISA检测方法,为EMC的流行病学和分子诊断奠定了基础。首先,将EMCV TJ株接种BHK-21细胞,24h后可见细胞圆缩、崩解。利用EMCV 3D基因的特异性引物对出现细胞病变的培养上清进行RT-PCR扩增,结果得到286 bp的目的片段,与预期的EMCV 3D片段长度一致。参考GenBank上EMCV的2C基因序列设计一对特异性引物,用RT-PCR技术对EMCV TJ株进行扩增,得到含有2C基因的特异性DNA片段。将此DNA片段继续用2C表达引物扩增,得到完整的2C基因,EMCV TJ株2C基因全长978个bp。EMCV TJ株2C基因与其它参考毒株的同源性在80.8%～99.8%之间,其中与BJC3的同源性最高达99.8%,与HB1为99.7%,与Mengo-M同源性最低为80.8%。其次,将预表达目的片段克隆入原核表达载体pGEX-6P-1中,在0.1mM IPTG诱导下pGEX-6P-2C在大肠杆菌中以包涵体的形式表达,表达蛋白的大小为61.6ku。重组蛋白经包涵体洗涤和SDS-PAGE电泳分离纯化后,进行PVDF膜鉴定,结果显示,重组蛋白可以被猪EMCV阳性血清特异性识别。最后,以纯化的2C蛋白为抗原,初步建立了检测EMCV抗体的间接ELISA方法。用建立的间接ELISA方法,并对天津7个县区91个规模化猪场的327份商品猪猪血清进行了检测,结果有86个猪场的260份血样为EMCV抗体阳性,猪场EMCV的抗体阳性率在75%～100%,平均阳性率为91.24%;血清EMCV抗体阳性率在58.33%～95.19%,平均阳性率为83.18%。检测结果表明,天津规模化猪场EMCV感染普遍存在。从上述血样中随机抽取295份,再用EMCV VP1蛋白为抗原进行ELISA检测,结果显示以2C蛋白和VP1蛋白为抗原分别检测猪血样中EMCV抗体,二者阳性率差异不显著,但EMCV 2C蛋白检测猪血样的抗体阳性率偏低。