研究目的和背景近年来认为胰岛中的各种细胞在特定环境下可能发生互相转化。最新研究揭示了2型糖尿病发病的新机制:在持续代谢压力下,胰岛β细胞失去自身属性,去分化为祖细胞（progenitor cells）并转分化为其他内分泌细胞。mTORC1为体内进化高度保守的丝苏氨酸激酶信号通路,感受上游营养物质及生长因子等的信号,对细胞的生长,增殖,代谢等具有重要调节作用。我们之前的研究证实,mTORC1通路参与β细胞的功能性成熟。为进一步研究mTORC1信号通路是否参与β细胞身份维持,我们借助在β细胞内特异性敲除Raptor（mTORC1的重要组成蛋白）的转基因示踪小鼠,以观察mTORC1通路对于胰岛β细胞身份维持的作用,探究其可能参与糖尿病发病的机制。材料和方法构建在胰岛β细胞内特异性表达EGFP的Raptor敲除或野生型小鼠。连续观察2到12周小鼠随机血糖、禁食6h血糖和体重水平的变化;在第8周进行糖耐量及检测禁食6h后血清胰岛素胰高血糖素水平,明确其糖代谢的表型。通过流式分选技术识别绿色荧光信号,得到纯化的β细胞。运用免疫荧光、免疫组化等方法研究βRapKO^GFP小鼠胰岛形态,胰岛各种细胞组成和β,α细胞重要转录因子的改变,以及GFP阳性细胞向其他细胞转化的可能。通过外源性胰岛素泵持续胰岛素注射,排除高糖干扰对转分化进行研究。培养INS-1细胞系,通过免疫蛋白印迹、RT-PCR、报告基因等方法研究mTORC1调控转分化的机制。结果1、βRapKO^GFP小鼠4周开始出现随机血糖和禁食6小时血糖的升高,8周时出现明显的糖耐量受损。8周血浆胰岛素水平降低,胰高血糖素没有明显差异。2、βRapKO^GFP小鼠β细胞质量明显下降,胰腺胰岛素含量明显减少。相反,胰岛α细胞绝对数目增加,α细胞/β细胞比例上调,α细胞质量增多。进一步研究证实,8周时α细胞增殖没有明显差异。3、8周时βRapKO^GFP小鼠胰腺免疫荧光染色证实,有6.63%GFP阳性细胞表达胰高血糖素。同时,我们发现敲除小鼠胰岛中存在胰高血糖素阳性细胞同时表达β细胞特异性转录因子PDX1、葡萄糖特异性转运体Glut2的现象。4.电镜结果进一步显示,β细胞分泌囊泡中出现α细胞分泌囊泡特征:大的,致密的,暗淡的不透光的光晕。5.使用流式细胞仪分选出WT和βRapKO^GFP小鼠的纯化的β细胞,我们发现敲除Raptor的GFP细胞中,α细胞特异性转录因子MAFB,ARX转录水平明显上调。6、2周时敲除小鼠的胰岛β细胞中已出现α细胞特异性转录因子MafB增加,而此时GFP阳性细胞并无ARX,胰高血糖素的表达。同时我们发现敲除胰岛中CCAAT区增强子结合蛋白β（C/EBPβ）异构体LAP的表达上调。进一步机制探讨,在INS-1细胞系上给予雷帕霉素处理,LAP的转录和翻译水平增加。过表达LAP后,MafB的转录水平上调,过表达LIP能够特异性竞争性LAP作用,MafB的转录水平下调。7、在我们的观察周期中（2周、5周、8周）βRapKO^GFP小鼠胰岛中的β细胞不存在去分化现象。8、给予4周βRapKO^GFP小鼠（4周-8周）外源性胰岛素治疗,控制血糖在正常水平后胰岛的形态、MafA明显纠正。胰岛素治疗后仍然有1.32%GFP阳性的胰高血糖素阳性细胞存在,明显高于周龄野生型对照（0.1%）。结论β细胞缺失mTORC1活性后,β细胞自身属性降低,α/β细胞比例明显增加,β细胞向α细胞发生了转分化。mTORC1通过调节LAP与LIP的比例,引起α细胞特异性转录因子MafB的表达增加,可能参与了β细胞向α细胞的转分化。mTORC1活性的调控可能为2型糖尿病治疗提供新的靶点,并且有助于体外诱导干细胞分化为功能成熟的β细胞。