番茄miR394抗晚疫病机制研究

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番茄(Solanum lycopersicum)易受多种病原菌的侵害,是研究植物患病机理的理想物种。晚疫病是番茄的一种毁灭性病害,发病时会造成严重减产。常规的防治方法存在极大局限性,因此利用基因工程手段发掘有利基因,培育抗病品种尤为重要。基因组上的非编码RNA(Non-coding RNA,nc RNA)在植物对生物胁迫的响应中起着关键作用,它包括微小RNA(Micro RNA,mi RNA)、长非编码RNA(Long non-coding RNA,lnc RNA)、小干扰RNA(Small interfering RNA,si RNA)等多种类型。mi R394属于mi RNA家族成员之一,其表达水平在病原菌侵染后会发生显著变化。实验室前期预测了mi R394的内源竞争性RNA(Competing endogenous RNA,ce RNA):lnc RNA40787,lnc RNA27177和lnc RNA42566。根据晚疫病菌侵染后的表达特性,最终挑选了lnc RNA40787进行下一步研究。随后分别过表达和沉默了mi R394及lnc RNA40787,阐明了mi R394与lnc RNA40787在番茄抗晚疫病中的作用机制及功能。首先,为探究mi R394在番茄抗晚疫病中起到的作用,本研究通过与植物高效表达载体连接以及短串联靶标模拟技术(Short tandem target mimic,STTM)构建了mi R394的过表达及沉默载体。利用瞬时侵染将两种重组载体转入番茄,发现mi R394的过表达会降低其靶基因LCR(Leaf Curling Responsiveness,LCR)的转录水平,影响茉莉酸(Jasmonic acid,JA)信号通路的关键基因表达,最终降低番茄对晚疫病感染的抵抗力;沉默后结果则与之相反。证明了mi R394的负调控作用。其次,在获得了mi R394相关的三个lnc RNAs(lnc RNA40787,lnc RNA27177和lnc RNA42566)的序列后,分析了这三个lnc RNAs上存在的内源靶标模拟(Endogenous target mimicry,e TM)位点。接种晚疫病菌后对mi R394、三个lnc RNAs、LCR的表达特性进行分析,发现三个lnc RNAs均呈现出明显的上升趋势,mi R394被显著抑制,LCR表达模式则与lnc RNA40787大致相同。以上结果证明三者确实会对该胁迫做出响应。进一步研究发现,在番茄植株瞬时过表达lnc RNA40787后,mi R394表达水平显著下降,LCR基因的表达量则明显上升,番茄对晚疫病的抗性得到了提高。该结果初步证明mi R394可被lnc RNA40787吸附,进而调控靶基因的转录水平,影响番茄对晚疫病的抗性。最后,构建了lnc RNA40787的沉默及突变载体。沉默lnc RNA40787后,mi R394的表达量显著升高,LCR的表达水平下降。接种晚疫病菌后,番茄叶片的病斑面积和病斑直径明显变大,植株抗病能力降低。为进一步说明lnc RNA40787与mi R394二者间的直接作用关系,瞬时转入了lnc RNA40787突变体载体p BI121-mlnc RNA40787,发现mi R394在p BI121-mlnc RNA40787转化叶片中表达量并无显著差异变化。综合以上结果,我们可以得出结论:mi R394的确可以被lnc RNA40787吸附。综上所述,本研究验证了lnc RNA40787是mi R394的ce RNA,明确了mi R394在番茄感染晚疫病后的负调控作用。我们的研究提出了lnc RNA40787-mi R394-LCR调控网络,为揭示番茄抗晚疫病的分子机制提供了理论基础和参考。
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