【摘 要】
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稻瘟病是重要的水稻病害之一,发病严重时降低水稻的产量,威胁粮食生产安全。micro RNA（miRNA）是一类碱基长度在20-24的小分子RNA,miRNA在调节植物生长过程中起着至关重要的作用。本文发现过量表达miR156fhl-3p的人工模拟诱捕靶标（MIM156-3p）增强水稻对稻瘟病菌的抗性,而没有产量损失。首先,我们发现miR156fhl-3p在感病材料LTH和抗病单基因系IRBLkm-
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稻瘟病是重要的水稻病害之一,发病严重时降低水稻的产量,威胁粮食生产安全。micro RNA（miRNA）是一类碱基长度在20-24的小分子RNA,miRNA在调节植物生长过程中起着至关重要的作用。本文发现过量表达miR156fhl-3p的人工模拟诱捕靶标（MIM156-3p）增强水稻对稻瘟病菌的抗性,而没有产量损失。首先,我们发现miR156fhl-3p在感病材料LTH和抗病单基因系IRBLkm-Ts中对稻瘟病菌诱导有响应。随后我们利用过量表达人工模拟诱捕靶标技术,构建了miR156fhl-3p表达量下调的转基因水稻MIM156-3p。我们对MIM156-3p转基因株系采用划伤和喷雾接种的方式,接种稻瘟病菌GZ8和97-27-2。实验结果显示,MIM156-3p叶片病斑长度较野生型更短更少,菌生物量检测实验显示其稻瘟病菌的菌量较野生型更少。为了探究为何降低miR156fhl-3p的表达会导致水稻更抗病,我们检测了接种稻瘟病菌后防御相关基因PR1a和NAC4的表达量。在接种稻瘟病菌48 hpi时,PR1a和NAC4两个基因在MIM156-3p中的表达量显著高于野生型材料。利用带荧光标签的GZ8菌株接种MIM156-3p叶鞘,我们发现在24 hpi和36 hpi时,菌的生长受到了抑制。因此,我们得出结论,降低miR156fhl-3p的表达量增强水稻的免疫响应反应同时限制稻瘟病菌的生长。通常免疫提升会伴随着产量的下调,统计分析结果表明,MIM156-3p的株型,分蘖数量,穗长与野生型没有显著差异;一级枝梗数量轻微下调但与对照相比无显著差异。然而二级枝梗数量显著下调,MIM156-3p的粒长和粒宽增加,导致千粒重增加,因此多方因素影响下,与野生型相比,MIM156-3p的单株产量没有显著变化。为了探究miR156fhl-5p增强水稻抗性的机制,我们进行了下游靶基因的筛选与验证,同时尝试通过其他途径解释该现象。我们发现在MIM156-3p中,miR156-5p的表达量被下调了,我们对pre-miR156fh进行检测,发现表达量也下调,说明miR156fhl-3p可能通过影响与之相应的miRNA-5p来行使功能。miR156靶定SPL14基因,SPL14通过绑定WRKY45启动子正调控其表达增强水稻对稻瘟病菌的抗性。在MIM156-3p中,未接种稻瘟病菌时SPL14和WRKY45表达量上调;接种稻瘟病菌48 hpi时,WRKY45相较于野生型显著上调表达。通过基于本氏烟瞬时表达的YFP荧光Reporter报告系统,我们进一步明确了MIM156-3p通过影响miR156-5p调控SPL14的表达。与过表达人工诱捕模拟靶标相反,过表达miR156（OX156）导致水稻对稻瘟病菌的感病性增强;在OX156转基因系中,SPL14和WRKY45的表达量降低。同时,我们也关注另一个差异表达的miRNA,即miR535。接种稻瘟病菌后,miR535在感病材料LTH中的表达量高于抗病材料IRBLkm-Ts。随后我们构建过量表达miR535（OX535）和过量表达miR535人工模拟靶标（MIM535）转基因株系。通过对OX535和MIM535进行划伤和喷雾接种稻瘟病菌,检测下游防御基因表达水平,观察稻瘟病菌侵染进程以及活性氧在侵染细胞中的累积,我们发现MIM535转基因植株相对野生型植株更抗病,而OX535更感病。为了进一步明确miR535的作用机制,我们通过RTq PCR和5’RLM-RACE实验证明了miR535靶定SPL14。综上所述,miR156fhl-3p会干扰miR156-5p行使功能,调节miR156-5p的靶基因SPL14及其下游基因WRKY45的表达,miR535则协同miR156-5p调控SPL14的表达,从而调控水稻对稻瘟病菌的抗性并不影响水稻产量,同时为miRNA的合成与积累提供了新的线索。
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