【摘 要】
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目的:肿瘤是指在体内外多种致癌因素的共同作用下,局部组织的某个细胞在基因水平上失去对其自身生长的正常调控,并随之发生多次遗传突变,导致细胞克隆性异常增生,并逐渐向周围正常组织侵染而形成的恶性病变。蛋白质是构成一切生物体的基本有机大分子,是生命活动的主要承担者,其复杂多样的空间化学结构决定了蛋白质功能的多样性。体内外环境改变所引起的蛋白质功能结构及表达的异常,将导致生命体多种疾病的发生,包括肿瘤。因
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目的:肿瘤是指在体内外多种致癌因素的共同作用下,局部组织的某个细胞在基因水平上失去对其自身生长的正常调控,并随之发生多次遗传突变,导致细胞克隆性异常增生,并逐渐向周围正常组织侵染而形成的恶性病变。蛋白质是构成一切生物体的基本有机大分子,是生命活动的主要承担者,其复杂多样的空间化学结构决定了蛋白质功能的多样性。体内外环境改变所引起的蛋白质功能结构及表达的异常,将导致生命体多种疾病的发生,包括肿瘤。因此,探讨蛋白质在肿瘤发生发展过程中的变化及其具体作用机制,将为肿瘤治疗提供新的切入点。蛋白质二硫键异构酶家族 A 成员 6（protein disulfide isomers family A,member 6;PDIA6）是本实验室通过高通量实验筛选和生物信息学分析,并经Western blotting实验验证的肺鳞癌相关蛋白,其在肺鳞癌组织中的表达较癌旁组织明显升高。大量研究结果显示,PDI家族主要分布在内质网和高尔基体的中间腔室,参与内质网应激（endoplasmic reticulum stress;ERS）反应,而内质网应激催化的未折叠蛋白反应（unfolded protein response;UPR）能够调控细胞凋亡和自噬的发生。本课题组的前期研究结果表明,PDIA6与Hela细胞增殖的发生发展密切相关,本研究拟用pCMV-sport6-PDIA6质粒瞬时转染Hela细胞,进一步探究PDIA6能否对内质网应激以及肿瘤细胞凋亡和自噬的发生发挥作用,从而为肿瘤治疗提供新的思路。方法:1.用pCMV-sport6-PDIA6质粒瞬时转染Hela细胞,使细胞内PDIA6的表达水平升高。2.利用透射电镜技术（TEM）观察细胞内凋亡和自噬现象的发生情况。3.分别用DAPI染色实验和流式细胞术检测PDIA6的高表达对细胞内凋亡的影响。4.利用Western blotting实验分别检测PDIA6高表达后细胞中内质网应激相关蛋白ATF6、IRE-1和PERK与凋亡相关蛋白cleaved-Caspase-3、cleaved-PARP、Bax和Bcl-2以及自噬相关蛋白Beclin-1的表达变化,以探究PDIA6对内质网应激及细胞凋亡和细胞自噬的调控作用。5.利用实时定量PCR实验技术检测PDIA6高表达后自噬相关基因LC3B的RNA表达水平,进一步探讨PDIA6与细胞自噬的关系。结果:1.Western blotting实验结果显示:与阴性对照组相比,瞬时转染入pCMV-sport6-PDIA6质粒的Hela细胞中,PDIA6的蛋白表达水平明显升高（p<0.05）。2.透射电镜技术结果显示:Hela细胞中存在凋亡和自噬现象的发生,并且PDIA6高表达后,发生自噬的细胞数量较阴性对照组有所增多。3.DAPI染色实验结果显示:与阴性对照组相比,PDIA6高表达后,发生凋亡的细胞比例下降（p<0.01）。4.流式细胞术结果显示:与阴性对照组相比,PDIA6高表达后,细胞的凋亡率下降（p<0.05）。5.Western blotting实验结果显示:与阴性对照组相比,PDIA6高表达后,内质网应激相关蛋白ATF6的表达上调（p<0.05）,IRE-1的表达下调（p<0.05）,而PERK的表达水平几乎没有变化（p>0.05）;细胞凋亡相关蛋白cleaved-Caspase-3 的表达下调（p<0.05）,cleaved-PARP 的表达下调（p<0.05）,Bax的表达下调（p<0.05）,Bcl-2的表达上调（p<0.01）;细胞自噬相关蛋白Beclin-1的表达上调（p<0.05）。6.实时定量PCR实验结果显示:与阴性对照组相比,PDIA6高表达后,自噬相关基因LC3B的RNA表达水平升高（p<0.01）。结论:1.PDIA6主要通过IRE-1和PERK途径调控Hela细胞中的内质网应激反应,从而维护细胞内质网内环境的稳定。2.PDIA6通过调控内质网应激反应,抑制细胞凋亡,促进细胞自噬,从而促进肿瘤细胞的生长,使肿瘤进一步恶化。
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