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物理、化学、生物是环境致癌的三大因素,而电离辐射是最常见的物理致癌因素之一,随着核能在国民经济和军事领域中的应用越来越广泛,电离辐射对人类的潜在危害也不断增加,辐射致癌是最重要的电离辐射远后效应,对辐射致癌分子机理进行研究,是肿瘤学、放射生物学、预防医学与辐射防护学探讨的重点。其研究成果涉及国民健康、能源利用、环境与战争,因而具有重要的社会、军事、经济与政治意义。大量的研究表明辐射可导致基因突变或染色体畸变,进而启动或推进细胞恶性转化,细胞恶性转化主要是基因突变、基因表达改变积累的结果,因此阐明辐射致细胞恶性转化的机理需从基因水平进行研究。已有的研究局限于为数不多的已知重要癌基因、抑癌基因,而肿瘤的发生是一个非常复杂的过程,涉及到很多与肿瘤相关基因的改变和功能异常,因此阐明辐射致癌机理需要从整体的角度,全面识别正常细胞与相应恶性转化细胞之间的差异表达基因,寻找未知的参与细胞恶性转化过程的基因。抑制差减杂交(SSH)就是以上研究的最有力工具之一,其依据的技术主要是抑制PCR和差减杂交。该方法得到的cDNA群体不仅<WP=5>富集了差异表达的基因,而且目的基因间丰度的差异经过均衡化作用已基本消除,特别适用于低丰度克隆的分离。同时该方法灵敏度高、重复性好,操作简便,初始mRNA仅需1～2ug,前后3～4天时间,即可得到富集的差减cDNA群体。该技术已经成为分子生物学领域研究两个细胞群体间差异表达基因的有力工具,为研究肿瘤发生发展中的基因开关及表达程序提供了极大的便利,推动了细胞遗传、生长、分化及癌变等许多领域的研究。但是高等动物作为高度分化的系统,其差异基因表达分析往往需要大量纯化的同质细胞,即便使用SSH技术也要求初始样本的mRNA达到1～2ug,即所需细胞数达到106数量级。大量同质细胞获取的困难无形中就增加了实验研究的难度,也阻碍了研究领域的扩展。常规的全组织获取样本方法,由于细胞异质性的影响,使得实验结果只能说明一个细胞群中基因表达的大致情况,而那些导致了细胞分型甚至细胞间唯一差别的表达特性却不能得知。而利用单细胞逆转录PCR方法代表性扩增全细胞mRNA,建立一微量细胞的基因表达分析系统,就能够解决分化系统的异质性和细胞全基因组表达模式分析所需大量纯化细胞获取困难之间的矛盾。单细胞逆转录PCR(SC-RT-PCR)通过序列非依赖性扩增,得到全细胞cDNA,从不同细胞中扩增的cDNA可用于构建差减文库或cDNA文库继而进行差异杂交,筛选不同细胞或组织间差异表达的基因。以此技术为基础,就可以建立微量细胞的基因表达分析系统,对数量稀少至单个细胞的样本进行基因表达的分析,这将极大的缓解大<WP=6>量同质细胞获取的困难,特别是对于来源极其有限的珍贵样本来说具有更大的意义。随着近年来基因组计划的顺利实施,应用该方法还可产生少到1个细胞的细胞类型/组织类型特异的或发育阶段特异的全细胞cDNA,并以此为探针来筛选微排列于DNA芯片上的cDNA文库,从而能够鉴定在这些细胞中所有基因的表达状态。同时,这种在单细胞水平上进行基因表达分析的技术,也将有助于揭示同质细胞中基因表达的个体独特性的现象,证实细胞对于基因表达调控的有限性。本研究分三个部分对以上问题进行了深入研究:首先建立稳定可靠的单细胞RT-PCR实验体系,包括序列非依赖性扩增全细胞mRNA的SC-Poly(A)PCR方法和引物特异性扩增目的基因的SC-RT-PCR方法,并对各个环节的条件进行了优化;其次选定一新的肿瘤抑制基因FHIT基因为研究对象,应用单细胞RT-PCR方法,对不同剂量60Coγ射线照射BEAS-2B细胞后人FHIT基因的早期动态变化进行了研究;最后以60Coγ射线照射诱发的小鼠白血病动物模型为研究对象,采用抑制差减杂交技术对辐射致小鼠肿瘤发生过程中的差异表达基因进行了全面的分析。结果发现:1、经过扩增代表性检测发现单个细胞中的全部mRNA都得到了有效扩增,电泳显示长度在0.2～2kb的片段居多,核酸定量发现扩增产物可达ug水平,足够常规分子生物学实验所用;2、以人β-actin和DPH2L基因片段为例,扩增产物在琼脂糖凝胶电泳上呈现一特异条带,表明单细胞RT-PCR对目的基因的扩增具有很好的特异性,同时该法重复性较好,产物测序亦表明该法<WP=7>具有良好的忠实性。3、FHIT基因各剂量组照后各时间点均存在一定的突变率,测序发现为外显子缺失突变,对照组未见突变。经过χ2统计分析,横向比较发现,照后24小时各剂量组间突变率无显著差异(P>0.05),照后72小时0.5Gy组、1Gy组分别与16Gy组突变率有显著差异(P<0.05),照后10天0.5 Gy组、1 Gy组分别与2 Gy组、4 Gy组、8 Gy组、16 Gy组的突变率有显著差异(P<0.05)。纵向比较发现,0.5 Gy组、1 Gy组照后24小时分别与照后72小时、照后10天的突变率有显著差异(P<0.05),其他剂量组各时间点间突变率无显著差异;4、小鼠胸腺肿瘤组织与小鼠正常胸腺组织的mRNA经抑制差减杂交得到差减cDNA文库,蓝白筛选得到102个阳性克隆,从中随机挑选30个克隆进行菌液PCR,扩增得到28个预期的特异性插入片段,长度介于500～1000bp之间,分别进行DNA测序,结果经与GeneBank数据库BLAST比对发现代表24个不同的已知基因,其中3个为重复检出基因,未发现有