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先天性特异性眼球震颤（idiopathic congenital. Nystagmus, ICN）是一种以发作性有节律的双侧眼球摆动为典型症状的遗传性异质性疾病,其中以女性X连锁不完全显性遗传最为常见。该病多在出生时及出生后六个月内出现症状,可持续终身,患者可伴有不同程度的视力下降,部分患者通过代偿头位来减轻眼球震颤的幅度和强度以提高视力,明显影响生活质量,目前尚无有效的治疗方法。2006年,Tarpey等首先克隆了X连锁ICN的致病基因-即酵母功能域包含蛋白7（ferm domain containing protein7, FRMD7）（NM194277）。继之,研究者对不同种族的家系及散发病例进行FRMD7基因突变分析,目前已发现FRMD7的突变位点40多个。2007年,我们对收集的X连锁ICN家系进行突变检测,发现了两个国际上新的错义突变（C.781C>G and c.886G>C）（国际突变数据库收录,分别命名为：HM070040及HM070041）和一个已报道的无义突变（c.1003C>T）,进一步确定了FRMD7基因在ICN发病机制中的重要性。FRMD7蛋白是4.1超家族蛋白的成员之一,编码714个氨基酸,其中含有一个与band4.1. Ezrin、Moesin、Radixin、Talin、Filopodin等一样的FERM结构域,约包含300个氨基酸,多位于蛋白的N端。有研究认为FERM结构域可能与通过膜相关蛋白（如Hyaluronan受体CD44,肌动蛋白骨架蛋白等）调节细胞的粘附和形态有关,因此推测FRMD7可能与从包膜受体到肌动蛋白细胞骨架的信号传导相关。近年来Betts-Henderson等研究发现FRMD7蛋白在神经元的发育过程中发挥着重要的作用,该作用可能与细胞骨架F-actin的调节相关。然而,FRMD7的确切功能及其在ICN发病机制中的作用仍不清楚。已有研究发现在神经元的生长发育过程中,FRMD7蛋白的同源蛋白（FARP1和FARP2）均起着重要作用。而FARP1和FARP2调节神经元的生长发育均与激活Rho GTPases相关；另外早有研究发现FERM家族蛋白Ezrin/Radixin/Moesin可与Rho GDP分离抑制分子结合从而激活Rho GTPases。 Rho GTPases （Rac1, RhoA和Cdc42）是真核细胞形态改变中肌动蛋白细胞骨架的关键调节者,参与神经元的发育与塑形,如神经突的生长,轴突的指导及树突修饰等过程。其功能上起着分子开关的作用,循环于两种状态之间,即激活的GTP状态和失活的GDP状态。这些发现均提示FRMD7调节神经元的发育可能也与Rho GTPases相关。因此在前期研究的基础上,我们对FRMD7基因的功能及其在调节神经元发育中的作用通路做了一系列的探索,本研究得到的结果如下：1.免疫组化示在孕16-17周,FRMD7蛋白在脑干（中脑,延髓,脑桥）高表达,这与控制眼球运动的神经核团主要位于脑干相一致。同时,此阶段FRMD7蛋白在小脑及间脑亦有表达。在后期（孕21周及25周）,FRMD7在脑干的表达量明显下降,在小脑及间脑基本无表达。在皮质,仅检测到在皮质下层有少量表达。2.细胞亚定位研究显示表达FERM-EGFP和FERM+FA-EGFP质粒的细胞内绿色荧光主要分布在细胞核内,而表达N端FERM或FERM+FA截短的ΔFERM-EGFP和ΔFERM+FA-EGFP质粒的细胞内绿色荧光则主要分布于胞浆,但表达比全长有所减弱；说明FRMD7的出核序列NES位于C端；3.与细胞亚定位结果一致,野生型FRMD7质粒,突变型C781G和G886C质粒的细胞内绿色荧光主要分布在细胞质内,而表达突变型C1003T质粒（C端截短）的细胞内绿色荧光主要分布在细胞核内。同时野生型FRMD7和突变型C781G, G886C均与F-actin有共定位,且无明显区别。由于突变型C1003T导致了C端的截短蛋白,细胞定位发生了改变,从而导致其与F-actin无共定位；4.在经维甲酸RA低血清诱导3天后过表达小鼠FRMD7蛋白的Neuro-2a细胞神经突起的长度较对照组伸长（对照组=68.99±2.59, FRMD7组=94.40±2.62,P<0.01）,分化为神经元的细胞数与对照组无明显区别（对照组38.63±3.65,FRMD7组41.87±3.46）；5.在过表达FRMD7蛋白后48小时,神经元特异性骨架相关蛋白基因,如微管相关蛋白Mtap2,低分子量和中分子量神经纤维丝（NF-L, NF-M）,微管相关Tau蛋白及神经元特异性核蛋白NeuN mRNA表达均显著升高,而其他相关神经元特异性基因则无明显变化；6.免疫共沉淀证实小鼠FRMD7与mRho GDIa存在相互作用,且GST pull down实验显示仅全长存在这种相互作用,无论mFRMD7N端或者C端单独都不能与mRho GDIa相互作用；7. GST pull down结果显示mFRMD7真核表达质粒与Rho家族小分子鸟苷三磷酸酶Rho GTPases表达质粒（Racl, Cdc42和RhoA）共转Neuro-2a细胞后,Racl/Cdc42的下游效应因子GST-PAK2融合蛋白捕获激活Racl-GTP蛋白的量明显大于对照组,而Cdc42与RhoA两组则与对照组无明显区别；8.Myc标签的Rho分离抑制分子GDI真核表达质粒与mFRMD7野生型质粒瞬时共转Neuro-2a细胞,anti-Myc印迹后,Western Blot检测anti-Rac1的表达较Rho分离抑制分子GDI真核表达质粒单独转染组减少；9.细胞转化实验显示在NIH3T3细胞过表达FRMD7,可引起细胞形态变化,并出现膜皱褶及板状伪足,即Racl激活表型；10. GST pull down提示hFRMD7真核表达质粒及其突变型与Racl表达质粒共转HEK293T细胞后,突变型组GST-PAK2融合蛋白捕获激活Racl-GTP蛋白的量明显小于对照组（野生型）；特别是突变型C1003T组,GST-PAK2融合蛋白几乎未捕获激活的Racl-GTP蛋白；11.免疫共沉淀实验揭示hFRMD7野生型及其突变型与Myc-Rho GDIa共转HEK293T细胞,anti-Myc印迹后,突变型与Rho GDIa的相互作用与野生型相比明显减弱,同时从Racl-Rho GDIa复合物中释放的Racl的量明显减少；尤C端截短的C1003T突变型,几乎不能与Rho GDIα相互作用,从而不能释放Rac1。综上所述,FRMD7蛋白可能在胎儿脑于的早期发育阶段发挥作用,且突变型FRMD7蛋白导致ICN的机制可能与F-actin相关；FRMD7蛋白可促进分化Neuro-2a细胞神经元突起的生长,该作用不仅跟F-actin有关,同时也与影响中间神经纤维丝及微管蛋白的动力相关。FRMD7能与Rho家族小分子鸟苷三磷酸酶Rho GTPases主要调节者之一Rho GDIα相互作用,且该作用需要其氨基端（N端）和羧基端（C端）同时存在,其C端也是FRMD7蛋白的出核序列NES所在；同时FRMD7蛋白与Rho GDIα相互作用后能从Rac1-Rho GDIα复合物中释放出Rac1从而特异性的激活Rac1信号通路,而突变型FRMD7蛋白因影响力与Rho GDIα相互作用,导致其释放的Rac1明显减少从而对Rac1通路的激活明显减弱甚至不能激活,提示突变型FRMD7蛋白对Rac1信号通路的影响可能与ICN的发病相关。