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目的:Annexin A1（ANXA1）是annexin蛋白超家族成员之一,在缺血性脑卒中损伤后神经元凋亡中起重要作用。我们前期研究证实ANXA1磷酸化修饰导致ANXA1核转位并参与缺血诱导的神经元凋亡过程;我们还发现:ANXA1能够与小类泛素蛋白修饰分子（SUMO）结合并被SUMO化修饰,这种修饰在脑缺血再灌注损伤后被明显削弱,而增加ANXA1-SUMO化修饰能显著减少脑缺血再灌注损伤后神经元凋亡及神经缺损体征。基于上述,本文将以神经元氧糖剥夺/复氧（OGD/R）后ANXA1-SUMO化修饰水平显著减少为切入点,探讨ANXA1-SUMO化水平降低与SUMO特异性蛋白酶（SENP）的关系,在此基础上,研究SENP及ANXA1去SUMO化修饰在OGD/R诱导的神经元凋亡中的作用机制。方法:（1）采用原代神经元细胞、HEK293T（人胚胎肾上皮细胞）和N2a细胞系,构建OGD/R细胞模型,通过Ni2+-NTA亲和层析技术检测神经元ANXA1苏木化修饰水平的改变;免疫共沉淀技术（Co-IP）筛选SENPs家族中与ANXA1发生相互作用蛋白酶;Co-IP和免疫组织化学的方法确定ANXA1和去苏木化酶之间的相互作用以及二者在脑片中的定位;（2）构建表达ANXA（WT,野生型）、ANXA1-SUMO2（SUMO2融合蛋白）和ANXA1突变体（SUMO结合位点突变,K113/161/257R,3KR）的质粒,在N2a细胞中,通过蛋白免疫印迹技术（IB）和免疫荧光双标检测ANXA1在细胞核中的分布;（3）通过IP和Co-IP技术检测ANXA1苏木化和磷酸化水平以及ANXA1与磷酸激酶PKC和TRPM7的相互作用;（4）通过荧光素酶报告基因、实时荧光定量PCR（RT-q PCR）和蛋白免疫印迹分别检测P53转录活性、Bid的m RNA水平以及Bid、t Bid的蛋白表达;（5）用腺病毒包装的ANXA1-WT、ANXA1-SUMO2、ANXA1-3KR感染神经元,免疫印迹检测ANXA1苏木化对凋亡相关cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9和cleaved PARP蛋白水平的影响;（6）Td T-mediated d UTP-X nick end labeling（TUNEL）染色和lactate dehydrogenase（LDH）释放试验检测神经元凋亡;结果:1.SENP6引起OGD/R后神经元ANXA1去苏木化作用:构建OGD/R细胞模型,利用Co-IP和Ni2+-NTA亲和层析技术检测OGD/R后ANXA1苏木化水平,结果显示:OGD/R后ANXA1的苏木化水平显著下降;为了探讨ANXA1苏木化水平减低的原因,在HEK293T细胞分别过表达ANXA1去苏木化酶SENPs家族分子（SENP1、SENP2、SENP3、SENP4、SENP5、SENP6、SENP7）,利用Co-IP技术筛选与ANXA1的关联,结果显示:过表达去苏木化酶SENP6引起ANXA1的苏木化水平明显下降,而转染SENP6突变体（SENP6-C1030S）或SENP6 sh RNA后,ANXA1苏木化水平显著增加。免疫荧光技术显示,ANXA1与去苏木化酶SENP6共定位于小鼠大脑皮层神经元,Co-IP技术显示:神经元OGD/R处理后,ANXA1与SENP6结合水平显著增加。上述结果提示,SENP6参与神经元OGD/R发生过程,这个过程与ANXA1去苏木化作用关联。2.SENP6去苏木化作用促进OGD/R诱导的ANXA1核转位:在N2a细胞中分别过表达ANXA1-WT（野生型）、ANXA1-SUMO2（过度SUMO化型）和ANXA1-3KR（SUMO结合位点三位点突变型）,免疫荧光双标技术检测OGD/R以后不同苏木化状态ANXA1的核分布情况,结果显示:OGD/R后ANXA-WT在细胞核的积累明显增加,而ANXA1-3KR突变体主要定位于细胞核,ANXA1-SUMO2倾向于定位于细胞质;为了检测OGD/R后去苏木酶SENP6对内源性ANXA1核定位的影响,在N2a细胞中过表达SENP6-WT（野生型）、SENP6-C1030S（酶活性位点突变型）或SENP6 sh RNA（RNA干扰）,免疫荧光技术显示:与Control组相比,OGD/R处理增加ANXA1在细胞核定位,SENP6-WT转染后使OGD/R诱导的ANXA1核定位进一步增加;转染SENP-C1030S和SENP6 sh RNA分别抑制SENP6酶活性或蛋白表达后,与OGD/R组比较,ANXA1在细胞核的定位明显减少。免疫印迹结果也同样提示:SENP6-WT转染后增加OGD/R诱导的ANXA1核转位,而SENP-C1030S和SENP6 sh RNA转染后减低了OGD/R诱导的核转位。上述结果提示:SENP6引起了OGD/R以后ANXA1的去苏木化修饰,并且促进了ANXA1的核转位。3.SENP6去苏木化作用诱导TRPM7和PKC激酶依赖的ANXA1丝氨酸残基磷酸化:为了探讨OGD/R后ANXA1去苏木化促进其核转位是否与ANXA1磷酸化修饰有关,我们首先检测了OGD/R后ANXA1磷酸化和苏木化水平的变化,结果显示:氧糖剥夺1 h,分别复氧3 h、6 h、12 h和24 h,ANXA1丝氨酸残基磷酸化水平随着复氧时间的延长而增加,24 h达高值;而ANXA1-SUMO化修饰水平则随着复氧时间的延长逐渐减少（后续研究中OGD/R均按氧糖剥夺1 h再复氧24 h处理）。随后,原代神经元细胞分别转染SNEP6-WT、SENP6-C1030S和SENP6 sh RNA并检测ANXA1丝氨酸残基磷酸化水平,结果显示:与SENP6-WT感染组相比,SENP6-C1030S感染后显著降低OGD/R引起的ANXA1的丝氨酸残基磷酸化水平;同样,感染SENP6 sh RNA也引起OGD/R以后ANXA1的磷酸化水平下调;利用Co-IP技术分别研究ANXA1与PKC、ANXA1与TRPM7激酶的关系,结果显示:OGD/R处理后,与Vector组相比,SENP6-WT过表达使得ANXA1与PKC、ANXA1与TRPM7结合均显著增多,而SENP6-C1030S和SENP6 sh RNA过表达降低了ANXA1与PKC、ANXA1与TRPM7的结合。上述结果提示:OGD/R后SENP6通过去苏木化ANXA1增加ANXA1丝氨酸残基磷酸化,并增强了OGD/R诱导的ANXA1的核转位;此外,这种磷酸化作用可能是PKC和TRPM7激酶依赖的。4.SENP6去苏木化ANXA1引起OGD/R后p53转录活性增加,并促进Bid蛋白表达增加:采用荧光素酶报告基因、RT-q PCR和WB技术分别检测p53转录活性、Bid m RNA表达及Bid蛋白水平,首先,在HEK293T细胞分别转染ANXA1-WT、ANXA1-SUMO2和ANXA1-3KR观察ANXA1-SUMO化对p53转录活性及Bid蛋白表达的影响,结果发现:与ANXA1-WT和ANXA1-SUMO2过表达组相比,ANXA1-3KR转染能显著增强OGD/R后p53的转录活性,并且增加了Bid m RNA和蛋白表达;为了检测SENP6是否介入其中,我们将SNEP6-WT、SENP6-C1030S和SENP6 sh RNA分别转染HEK293T细胞并检测OGD/R后p53转录活性及Bid表达变化,结果发现:OGD/R后,转染SENP6-WT使p53的转录活性、Bid的m RNA水平以及Bid、t Bid蛋白表达都明显升高,SENP6-C1030S和SENP6 sh RNA转染组降低了OGD/R引起的p53转录活性、Bid m RNA表达及Bid蛋白水平也显著减少。上述结果表明:OGD/R后SENP6通过去苏木化ANXA1增强p53转录活性,增加Bid m RNA和蛋白水平。5.SENP6去苏木化ANXA1促进了OGD/R后凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-9和PARP活化:首先,利用腺病毒包装ANXA1-WT、ANXA1-SUMO2和ANXA1-3KR质粒感染原代神经元,利用免疫印迹技术检测凋亡相关caspase-3、caspase-9和PARP剪切体蛋白的变化,判断ANXA1-SUMO化对凋亡相关蛋白活化的影响。结果显示:与ANXA1-WT感染组相比,ANXA1-SUMO2感染组凋亡相关caspase-3、caspase-9和PARP的剪切体蛋白水平明显降低,而ANXA1-3KR促进了OGD/R后凋亡相关caspase-3、caspase-9和PARP的蛋白活化;为了检测SENP6对凋亡相关蛋白活化的影响,我们用腺病毒包装SNEP6-WT、SENP6-C1030S和SENP6 sh RNA质粒感染原代神经元,结果显示:OGD/R以后,SENP6-WT感染组中凋亡相关caspase-3、caspase-9和PARP的剪切体蛋白明显增加,而SENP6-C1030S和SENP6 sh RNA感染后减低了凋亡相关蛋白的活化;为了研究SENP6对凋亡蛋白活化的影响是否与ANXA1有关,我们用SENP6和ANXA1或ANXA1 sh RNA（ANXA1干扰RNA）的腺病毒感染神经元细胞,免疫印迹结果显示:与单独感染SENP6和单独感染ANXA1或ANXA1 sh RNA相比,同时感染SENP6和ANXA1使得凋亡相关蛋白的活化明显升高,相反,同时感染SENP6和ANXA1 sh RNA促使cleaved caspase-3、cleaved caspase-9和cleaved PARP的水平明显降低;另外,在感染ANXA1-WT、ANXA1-SUMO2和ANXA1-3KR的基础上感染SENP6-WT或SENP6 sh RNA,免疫印迹结果显示:OGD/R条件下,与Vector组相比,SENP6-WT使得ANXA1-WT组的神经元凋亡相关蛋白活化明显升高,而SENP6-C1030S抑制了ANXA1-WT组凋亡相关蛋白的活化,但是对ANXA1-SUMO2和ANXA1-3KR组神经元影响不大,说明SENP6对凋亡蛋白活化的影响是通过其对ANXA1去苏木化的作用实现的;上述结果表明:SENP6增加了OGD/R后凋亡相关的caspase-3、caspase-9和PARP剪切体蛋白的水平,这一作用是由其去苏木化ANXA1的酶活性实现的。6.SENP6去苏木化ANXA1促进了OGD/R后神经元凋亡:首先,我们用腺病毒包装ANXA1-WT、ANXA1-SUMO2和ANXA1-3KR质粒感染神经元,采用TUNEL染色和LDH释放实验检测OGD/R后ANXA1苏木化对神经元凋亡的影响,结果显示:OGD/R以后,与ANXA1-WT感染组相比,ANXA1-SUMO2感染组的TUNEL阳性细胞数量和LDH释放都明显降低,而神经元感染ANXA1-3KR促使OGD/R后TUNEL阳性细胞数量和LDH释放都明显升高;为了探讨SENP6对神经元凋亡的影响,我们用SNEP6-WT、SENP6-C1030S和SENP6 sh RNA的腺病毒感染神经元,结果显示:与Control组相比,OGD/R处理引起TUNEL阳性细胞数量增加、LDH释放增加,SNEP6-WT感染神经元后促使OGD/R后TUNEL阳性细胞数量、LDH释放进一步升高,而SENP6-C1030S和SENP6 sh RNA感染后减低了TUNEL阳性细胞数量和LDH的释放;上述结果表明:SENP6去苏木化ANXA1增强了OGD/R条件下神经元的凋亡;为了探讨OGD/R以后SENP6介导的神经元凋亡是否取决于它去苏木化ANXA1的酶活性,我们用腺病毒包装SENP6和ANXA1或ANXA1sh RNA质粒感染神经元,TUNEL染色和LDH释放实验结果显示:与单独感染SENP6和单独感染ANXA1或ANXA1 sh RNA相比,同时感染SENP6和ANXA1引起TUNEL阳性细胞数量增加、LDH释放增加,相反,同时感染SENP6和ANXA1 sh RNA减低了TUNEL阳性细胞数量和LDH释放;另外,在感染ANXA1-WT、ANXA1-SUMO2和ANXA1-3KR的基础上感染SENP6-WT或SENP6 sh RNA,结果显示:OGD/R条件下,与Vector组相比,SENP6-WT使得ANXA1-WT感染组的神经元凋亡明显升高,而SENP6-C1030S抑制了ANXA1-WT感染组组神经元凋亡,但是对ANXA1-SUMO2和ANXA1-3KR组神经元凋亡无明显影响,说明SENP6对神经元凋亡的影响是通过其对ANXA1去苏木化的作用实现的;综上所述,这些结果表明:SENP6通过去苏木化ANXA1的酶活性促进了OGD/R诱导的神经元凋亡。结论:1.OGD/R处理诱导神经元去苏木化酶SENP6与ANXA1结合水平增加,并引起ANXA1去苏木化导致ANXA1苏木化修饰水平降低;2.SENP6对ANXA1去苏木化修饰促进OGD/R后ANXA1核转位增加,这种核转位增加可能与SENP6去苏木化作用增强OGD/R诱导的TRPM7和PKC激酶依赖的ANXA1丝氨酸残基磷酸化相关;3.SENP6去苏木化ANXA1引起OGD/R后p53转录活性增强,由此诱导Bid蛋白表达水平增加,凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-9和PARP剪切激活,诱导的神经元凋亡。