蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）是一种豆科模式植物,基因组小,遗传信息简单,广泛用于分子生物学基础研究,研究数据具有代表性,为其它豆科植物的品种改良提供遗传依据。Dof（DNA binding with one finger）家族转录因子是植物所特有的一类锌指蛋白,蛋白结构中包含一个特有的Dof保守结构域,通常由DNA结合域和转录调控域组成,其中转录调控结构域的氨基酸序列较为多变,使得Dof蛋白的功能较为多样。已有研究表明,Dof蛋白在植物生长发育过程中发挥了重要生物学功能,涉及花期调控和器官发育等方面。虽然以往关于Dof功能已有较多研究,但其参与植物叶片生长发育调控网络尚不完善,依然有较大研究潜力。本人所在课题组在先前的基因功能研究中发现,蒺藜苜蓿中一些Dof家族成员影响了下游叶片发育相关基因的表达,通过生物信息学分析和表达特征分析筛选出MtDof32基因。在此研究背景下,本文旨在从蒺藜苜蓿中克隆出MtDof32基因,研究该基因功能,通过蛋白互作和表达分析了解其参与生长发育和抗逆调控的分子机理。本研究主要围绕MtDof32基因的克隆、生物信息学分析、基因表达模式、亚细胞定位、过表达转基因株系的生理生化分析和蛋白互作等方面开展了研究,得到如下研究结果:1.根据蒺藜苜蓿基因组信息,克隆得到MtDof32的c DNA全长。生物信息学分析表明,MtDof32编码486个氨基酸,属于Dof家族第Ⅱ亚族,该基因启动子顺式元件包含有生长发育和逆境相关的元件。2.表达模式分析显示,MtDof32的表达量在叶中最高,比花中高16倍;MtDof32的表达受到非生物胁迫（PEG、Na Cl、4℃）的诱导和外源激素（ABA、GA3、SA）的抑制。3.与野生型拟南芥相比,过表达MtDof32植株叶片和花器官明显变大,总分枝数平均减少4.6个～5个,开花时间晚13天～20天;在渗透和盐胁迫条件下,转基因拟南芥和野生型拟南芥的生长均受到明显的抑制,但转基因植株的根长和鲜重指标显著高于野生型植株,这表明过表达MtDof32提高了拟南芥对渗透和盐胁迫的耐受力。4.在MtDof32转基因拟南芥中对独脚金内酯合成途径相关基因At DWARF27、At CCD7、At CCD8、At MAX1、At MAX2、At SMXL6、At SMXL7、At SMXL8表达水平进行检测,分析结果显示At DWARF27、At CCD7、At CCD8的表达水平无明显变化,而At MAX1、At MAX2的表达水平显著上调,At SMXL6、At SMXL7、At SMXL8表达水平显著下降。这些结果暗示MtDof32可能对独脚金内酯的合成或转运产生影响,进而调控了植物分枝。5.过表达MtDof32显著影响了蒺藜苜蓿的生长发育。与野生型蒺藜苜蓿相比,转基因植株叶片和花器官明显变大,开花时间平均晚8天～11天,生长45天时一级分枝数平均减少1.7个～1.8个。扫描电镜实验结果显示,MtDof32转基因蒺藜苜蓿叶片细胞体积显著增大。6.为解析MtDof32对植物器官大小的调控机制,以MtDof32为诱饵蛋白进行酵母文库筛选,得到互作蛋白MtEBP1。亚细胞定位分析结果表明MtDof32和MtEBP1蛋白均定位于细胞核。双分子荧光互补实验表明,MtDof32与MtEBP1在细胞核互作。MtDof32转基因蒺藜苜蓿中MtEBP1的表达水平提高,表明MtDof32与MtEBP1协同作用,共同调控植物器官的生长发育。本研究结果表明MtDof32是调控植物生长发育的重要转录因子,并可在抵御非生物胁迫等方面发挥作用。本研究深入解析了MtDof32在植物器官生长发育和分枝调控过程中的作用机制,为相关苜蓿新品种的选育提供了理论依据。