二穗短柄草BdFLS2的基因编辑与禾本科抗病磷酸化蛋白组学研究

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植物对病原菌抗病反应的启动始于细胞表面的受体,它们能够识别高度保守的病原相关分子模式,并通过一系列蛋白磷酸化过程将刺激信号传入细胞内部,调控防卫基因的表达。目前植物抗病的分子机制在双子叶模式植物拟南芥中的研究较为成熟,但在禾本科植物中的报道并不充分。植物病害问题一直以来都困扰着农业生产,而禾本科当中则有着当前世界上最重要的食物、饲料等物种,所以研究禾本科植物识别病原微生物信号并将该信号传导到细胞内引起抗病反应的机制具有重要意义。为了研究禾本科植物的抗病分子机制,本研究以两种经典的禾本科模式植物二穗短柄草和水稻为研究对象,通过CRISPR/Cas9基因组编辑技术获得重要的突变体植株,并基于磷酸化蛋白组分析筛选重要的抗病磷酸化蛋白,经过进一步的生化实验验证,取得如下结果:(1)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,在二穗短柄草中成功获得了与PTI相关的重要受体激酶的敲除突变体bdfls2,并通过激发子处理检测ROS爆发和防卫基因表达进一步验证了该受体蛋白参与相应的病原相关分子模式flg22的识别过程当中。(2)FLS2尚不能全面解析PTI反应的过程,而在二穗短柄草中抗病相关的蛋白激酶研究较少。鉴于磷酸化蛋白组学研究在禾本科模式植物水稻中技术较二穗短柄草为成熟,本研究中以水稻悬浮细胞为对象,利用来源于植物细胞壁的寡聚半乳糖醛酸(OGs)作为激发子激活PTI反应,利用非标记定量的磷酸化蛋白质组学方法从OGs处理和未处理的水稻悬浮细胞中获得了磷酸化蛋白质数据,其中差异磷酸化位点共1175个,对应449个差异表达的磷酸化蛋白。(3)通过组学分析,发现OGs潜在受体OsWAK1,及9个参与水稻抗病信号传导的可能的重要节点蛋白,并通过基因编辑成功获得了一系列基因敲除突变体,经过生化实验初步确定OsWAK1可被OGs的诱导激活PTI反应。(4)基于flg22处理水稻幼苗引起侧根生长抑制的表型,通过证明侧根生长抑制的同时其他PTI指标如MAPKs激活以及相关防卫基因激活均显著发生,且不同PAMPs处理均可引起水稻幼苗侧根生长抑制,同时在不同的水稻生态型中该表型保守存在。建立起了一套基于PTI响应抑制侧根生长的适用于稻科植物的简单高效的PTI检测方法,为后期大规模的突变体鉴定奠定了方法基础。综上所述,本研究基于磷酸化蛋白组学筛选了一系列抗病相关的目的蛋白,为禾本科植物的抗病研究提供了新的磷酸化蛋白组学支持。并获得了大量潜在的抗病相关磷酸化蛋白的突变体,奠定了良好的材料基础。同时建立了一套简单高效的突变体筛选体系,为大规模筛选PTI反应突变体材料提供了一套完备的方法。本研究将对阐释禾本科植物的广谱抗病的分子基础和抗性新品种的开发具有重要意义。
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