拟南芥IQM1互作蛋白的筛选与初步鉴定

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AtIQM1由At4g33050编码。本课题组的前期研究表明,IQM1编码一个Ca2+不依赖的钙调素结合蛋白(calmodulin-binding protein,CaMBP),介导CaM、光和部分非生物胁迫信号的转导,参与气孔防卫和根生长发育的调节。本文拟通过分析植物中IQM1的蛋白量、IQM1互作蛋白的酵母双杂交筛选、双分子荧光互补实验验证以及CRISPR/Cas9基因组编辑技术构建互作蛋白基因突变体等方法,进一步研究IQM1在拟南芥中的分子机能,结果如下:1.通过IQM1半定量RT-PCR分析,转基因植株P35S:HA-IQM1的IQM1基因的表达量远远高于野生型Col,但在蛋白表达量分析中,P35S:HA-IQM1的Western Blot显影结果显示为无条带。2.构建诱饵蛋白表达载体pGBKT7-IQM1,与拟南芥幼苗cDNA文库AD质粒共转化酵母AH109株系,经过初筛、复筛、测序得到了15个候选互作蛋白,构建这15个基因的pGADT7载体,并分别与pGBKT7-IQM1质粒共转化酵母AGB109株系,一对一进行酵母双杂交互作验证,初步确定编码蛋白At5g51570、转录因子TCP21及LSU1能与IQM1蛋白在酵母体内互作。3.构建TCP21和LSU1基因的双分子荧光互补载体,制备野生型Col叶片的原生质体,利用质粒共转化原生质体,并在激光共聚焦显微镜中观察、拍照。结果显示pSAT1-nEYFP-IQM1与pSAT1-cYFP-TCP21、pSAT1-cYFP-IQM1与pSAT1-nEYFP-TCP21、pSAT1-nEYFP-IQM1与pSAT1-cYFP-LSU13个组合以及pSAT1-cYFP-IQM1与pSAT1-nEYFP-LSU1组合在原生质体中都能发出荧光。这说明IQM1与TCP21以及LSU1在植物细胞中存在相互作用。4.利用CRISPR/Cas9技术,构建了IQM1互作蛋白与TCP21和LSU1的基因组编辑载体,为了后续研究IQM1与TCP21和LSU1的遗传关系奠定了材料基础。
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