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子宫内膜异位症(Endometriosis, EMs)是具有生长功能的子宫内膜组织出现在子宫腔被覆内膜及宫体肌层以外的其他部位。它一种常见良性妇科疾患,却有增生、浸润、转移、复发等恶性行为,严重影响妇女的身心健康、生活质量和生育能力。关于其发病机制众说纷纭,目前仍以种植学说为主导理论,但子宫内膜细胞如何脱离起源位置并完成宫腔外异位粘附-侵袭-血管形成等复杂过程,特别是细胞如何接收内外信号引起细胞迁移这一关键性步骤及其调控因子尚未阐明。而这一关键性步骤直接导致了子宫内膜细胞的迁徙及EMs复发,所以有必要对子宫内膜细胞迁徙及调控机制进行深入研究探讨。肝再生磷酸酶-3(Phosphatase of Regenerating Liver-3,PRL-3)是肝再生磷酸酶家族中的一员,因近年发现与肿瘤转移有非常密切的关系而备受关注。自2001年Saha等发现PRL-3与结肠癌转移有密切关系以来,越来越多的研究表明：PRL-3的高表达似乎是多种肿瘤发生发展过程(特别是转移过程)中的一个共性事件,它能激活细胞内一系列信号转导通路,诱导细胞增殖和分化、提高其浸润转移能力、诱导血管新生,从而促进肿瘤的形成及肿瘤细胞向其他组织器官的转移等。最近研究显示：在促进肿瘤发生发展方面,PRL-3作为一个上游信号与特定的蛋白结合,开启下游Rho/ROCK信号转导通路,最终导致细胞增殖、迁移等能力的改变。已有研究表明RhoA和ROCK在异位子宫内膜间质细胞高表达,而有关PRL-3与子宫内膜异位症的关系国内外尚无研究报道。基于上述的研究背景,我们设计了本课题,首先从临床组织水平利用免疫组化、蛋白印迹(Western Blot)技术,比较PRL-3在EMs患者异位、在位子宫内膜及非EMs患者子宫内膜的表达,探讨PRL-3异常表达与子宫内膜异位症的相关性；然后从细胞分子水平原代培养子宫内膜间质细胞,建立离体细胞迁徙模型,运用划痕实验、transwell细胞迁徙浸润实验比较异位、在位、非EMs子宫内膜间质细胞的迁徙能力,并用实时定量逆转录-聚合酶链反应(real-time RT-PCR)、 Western Blot方法比较三种细胞中PRL-3、总-RhoA(T-RhoA)、磷酸化-RhoA(P-RhoA)及ROCK基因的表达差异；最后用小干扰RNA(siRNA)技术干扰沉默PRL-3基因,并用real-time RT-PCR、 Western Blot方法比较转染前后PRL-3、T-RhoA、 P-RhoA及ROCK基因表达变化,再利用激光扫描共聚焦显微镜、划痕实验、transwell细胞迁徙实验等技术,了解转染后异位子宫内膜间质细胞的细胞骨架及迁徙能力的改变,深入研究PRL-3介导的RhoA/ROCK信号转导通路对异位内膜细胞迁徙的调控作用及其分子机制,从而进一步揭示EMs发生发展机制,为该病的防治提供一种新的思路。第一部分PRL-3异常表达与子宫内膜异位症的相关性研究目的：探讨PRL-3异常表达与子宫内膜异位症的相关性。方法：选取70例异位、在位子宫内膜组织及30例非EMs患者子宫内膜组织用于免疫组化研究,并随访3年；选取35例异位和在位子宫内膜组织及20例非EMs患者子宫内膜组织用于蛋白印迹检测,比较PRL-3蛋白在异位、在位及非EMs患者子宫内膜组织中的表达差异。结果：免疫组化染色显示：PRL-3蛋白表达主要定位于异位子宫内膜腺上皮细胞以及成纤维细胞、血管内皮细胞等间质细胞的胞膜、胞浆,70例异位子宫内膜标本中有51例PRL-3蛋白阳性表达,阳性率为72.9%,而在位、非EMs患者子宫内膜PRL-3蛋白阴性表达,PRL-3在异位子宫内膜组织的表达明显高于在位、非EMs患者子宫内膜,差异有显著性(P<0.001)；早期Ⅰ/Ⅱ患者PRL-3蛋白阳性率53.3%(16/30),而晚期Ⅲ/Ⅳ患者PRL-3蛋白阳性率87.5%(35/40),两者间有显著性差异(P<0.01)；复发组PRL-3蛋白阳性率90.0%(18/20)较未复发组PRL-3蛋白阳性率66.0%(33/50)高,差异有显著性(P<0.05)。经Western Blot方法检测发现：35例异位子宫内膜组织中有29例PRL-3蛋白阳性表达,阳性率为82.9%,而在位、非EMs患者子宫内膜组织中未检测出PRL-3蛋白表达,异位子宫内膜组织PRL-3蛋白表达明显高于在位、非EMs患者子宫内膜,有显著性差异(P<0.001)。结论：PRL-3蛋白在异位子宫内膜的表达明显高于在位及非EMs患者子宫内膜,并且与EMs的分期及复发密切相关。第二部分比较三种子宫内膜间质细胞迁徙能力及PRL-3/RhoA/ROCK信号转导通路表达目的：体外原代培养异位、在位、非EMs患者子宫内膜间质细胞,比较三种子宫内膜间质细胞迁徙能力及PRL-3/RhoA/ROCK信号转导通路表达差异。方法：体外原代培养异位、在位、非EMs患者子宫内膜间质细胞,建立离体细胞迁徙模型并鉴定间质细胞,运用划痕实验、transwell细胞迁徙浸润实验比较三种细胞的迁徙能力；采用real-time RT-PCR、Western Blot方法比较三种细胞中PRL-3、T-RhoA、 P-RhoA及ROCK基因的表达差异。结果：transwell实验显示,相同时间内穿越Matrigel基质胶迁移浸润的异位、在位及非EMs子宫内膜间质细胞数分别为：4.13±0.81、2.65±1.07、1.45±0.39,经方差分析三组间差异均有统计学意义(F=107.93,P<0.05),经SNK法分析异位组与在位组相比较差异有统计学意义(P<0.05),在位组与非EMs组之间比较也有显著性差异(P<0.05)；细胞划痕实验同样显示相同时间内异位子宫内膜细胞迁徙能力强于在位子宫内膜细胞,而在位子宫内膜细胞又强于非EMs,患者子宫内膜细胞。经Western Blot检测分析发现,异位子宫内膜细胞PRL-3蛋白相对表达量为0.245±0.132,而在位及非EMs子宫内膜组未检测出PRL-3蛋白表达,经方差分析三组细胞PRL-3蛋白相对表达量有显著性差异(F=362.84,P<0.01)。经Western Blot检测发现T-RhoA、P-RhoA、Rock蛋白在异位子宫内膜细胞的表达最强,在位子宫内膜细胞中表达次之,而在非EMs,患者子宫内膜细胞表达最弱(P<0.05)。而real-time RT-PCR检测(?)PRL-3、RhoA. Rock的nRNA表达,同样发现在异位子宫内膜细胞的表达最强,在位子宫内膜细胞中表达次之,而在非EMs患者子宫内膜细胞表达最弱(P<0.05)。结论：1.子宫内膜间质细胞的迁徙能力：异位>在位>非EMs患者子宫内膜；2. PRL-3/RhoA/ROCK信号通路的表达：异位>在位>非EMs患者子宫内膜。第三部分PRL-3介导的RhoA/ROCK信号转导通路对异位子宫内膜细胞迁徙的调控作用研究目的：通过siRNA技术干扰沉默PRL-3基因,深入研究PRL-3介导的RhoA/ROCK信号转导通路对异位内膜细胞迁徙的调控作用及其分子机制。方法：体外原代培养异位子宫内膜间质细胞建立离体迁徙模型,用PRL-3siRNA转染异位子宫内膜间质细胞,采用real-time RT-PCR、Western Blot方法检测PRL-3、T-RhoA、 P-RhoA及ROCK基因在转染前后的表达变化；运用划痕实验、transwell实验等观察转染前后细胞迁徙能力的变化；并通过激光扫描共聚焦显微镜观察转染前后细胞骨架构型的改变。结果：转染后72h实验组、阴性对照组及空白对照组PRL-3的蛋白相对表达量为0.049±0.052、0.364±0.128、0.418±0.090,经方差分析三组间PRL-3蛋白相对表达量差异有统计学意义(F=343.47,P<0.05),经SNK法检验实验组与两对照组相比较差异有统计学意义(P<0.05),而两对照组之间的差异无统计学意义(P>0.05)；PRL-3siRNA转染0～72h后PRL-3、T-RhoA、P-RhoA、Rock基因的蛋白表达呈下降趋势,尤以PRL-3下降最为明显,并且在转染最初的24～48h这种抑制作用最为迅速、明显,72h抑制率可达到81.4%,而且P-RhoA的变化趋势与PRL-3较为一致,经检验转染组与两对照组相比各基因蛋白表达的差异有统计学意义(P<0.05),而两对照组之间无明显差异(P>0.05)；转染0～72h后PRL-3、RhoA、 Rock基因mRNA的表达亦呈下降趋势,在转染最初的24～48h下降最为迅速,经检验转染组与两对照组相比差异有统计学意义(P<0.05),而两对照组之间无明显差异(P>0.05)。当对照组的培养基作用于血清饥饿的异位子宫内膜间质细胞后,细胞形成明显的板状伪足,而实验组经PRL-3siRNA干扰后细胞中未能见到典型的板状伪足。transwell实验显示,相同时间内穿越Matrigel迁移浸润的实验组、阴性对照组和空白对照组细胞数分别为：0.87±0.21、1.63±0.39、1.75±0.28,经方差分析三组间差异均有统计学意义(F=103.69,P<0.05),经SNK法分析实验组与两对照组相比较差异有统计学意义(P<0.05),而两对照组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。经激光扫描共聚焦显微镜发现,转染后实验组异位子宫内膜间质细胞中应力纤维数目明显增多、变粗而清晰,而细胞的丝状、板状伪足却明显减少。结论：1.PRL-3siRNA能有效沉默PRL-3基因,下调RhoA/ROCK信号转导通路；2.转染PRL-3siRNA后异位子宫内膜间质细胞的迁徙能力明显下降；3.PRL-3介导EhoA/ROCK信号通路对异位子宫内膜细胞迁徙发挥调控作用。