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棉花细菌性角斑病、大豆斑疹病以及菜豆和豇豆的细菌性疫病均是作物生态系统中重要的致灾性细菌性病害,分别由黄单胞菌属的棉花角斑病菌（Xanthomonas campestris pv.malvacearum,Xcm）、大豆斑疹病菌（X.axonopodis pv.glycines,Xag）、菜豆细菌性疫病菌（X.campestris pv.phaseoli,Xcp）和豇豆细菌性疫病菌（X.axonopodis pv.vigniacola,Xav）引起。与稻黄单胞菌等其他病原黄单胞菌一样,这些病原细菌都是通过体内保守的Ⅲ型分泌系统（Type-III secretion system,T3SS）将III型效应子（T3SS-secreted effectors,T3SEs）分泌到寄主细胞内,抑制寄主植物的免疫反应从而使寄主植物产生抗病性或感病性。T3SEs主要有两类,一类是转录活化类似因子（Transcription activation-like effectors,TALEs）,另一类是Non-TALE效应蛋白,也称为Xop（Xanthomonas outer proteins）蛋白。已有研究发现,TALE蛋白通过作用于寄主植物中的靶标基因,决定了植物病害的症状和植物的抗（感）性。然而,棉花细菌性角斑病菌、大豆斑疹病菌以及菜豆和豇豆细菌性疫病菌中的TALE类型、数量和多样性,这些TALE蛋白在细菌致病性中的作用以及它们在寄主植物中的靶标基因,还少见报道。为此,本文以这4种黄单胞菌为对象,对它们中的tal基因进行了分离,并对它们在寄主植物中的作用靶标进行了鉴定。主要研究结果如下。1.四种黄单胞菌遗传操作体系的构建为了探明tal基因是否能够进行knock-out和knock-in等遗传学操作,本研究选择四种黄单胞菌代表菌株,即大豆斑疹病菌（Xag）的ATCC43911菌株、辣椒斑点病菌（Xav）ATCC19865菌株、菜豆细菌性疫病菌（Xcp）的ATCC49119菌株和棉花角斑病菌（Xcm）的Xss-V2-18菌株,作为出发菌株。根据tal基因的高度保守性,构建了可用于同源交换的含转座子Tn5的p B-C8B::Tn5质粒。通过电转化法转入上述受体菌细胞中,再进行Km抗性筛选,发现该质粒可以进入该四种黄单胞菌中。鉴于C8B是来源于稻黄单胞菌的tal基因,推测具有Km抗性的克隆可能发生了tal基因间的同源重组。进一步提取大豆斑疹病菌（Xag）ATCC43911菌株中具有Km抗性的克隆的基因组,以tal基因中间区域的Sph I片段构建探针,进行Southern杂交。结果显示,ATCC43911菌株含有6个tal基因,在Tn5转座子插入后,tal基因的位置发生了变化,杂交信号条带数目增加,并且存在Tn5的单拷贝和双拷贝插入两种形式。这表明Tn5转座子成功插入了tal基因。tal基因Tn5插入突变体的构建为进一步分离和敲除tal基因以及鉴定其在致病性中的作用奠定了工作系统。2.棉花角斑病菌tal基因缺失突变体的获得和其在棉花上致病性的测定基于携带tal基因的Tn5转座子突变技术获得的黄单胞菌,只能实现tal基因的插入突变。为了获得tal基因的敲除,在自杀质粒p KMS1载体上构建了融合tal基因重复区域外左右两段臂的载体p KMSA1和p KMSA2。将p KMSA1通过电转化的方法导入Xss-V2-18细胞中,通过Km抗性和蔗糖培养基筛选,获得了在NA上生长但对Km敏感的突变体。经过菌落-PCR筛选,获得了含tal基因融合片段的候选突变体。提取候选突变体的基因组,经Bam HI酶切后与tal基因的Sph I片段为探针进行Southern杂交,根据tal基因带谱,获得了M1、M2、M3和M4突变体。与野生型菌株tal基因带谱相比,M1突变体缺失tal3基因,M2缺失tal2基因,M3缺失tal2和tal4基因,M4缺失tal2、tal4、tal5和tal6基因。以M4为出发菌,利用p KMSA2进行剩余tal基因的敲除,按照上述筛选步骤,经过Southern杂交,获得了M5和M6突变体。M5突变体缺失了tal3,M6缺失全部6个tal基因。将突变体注射接种棉花子叶上,发现与野生型菌株相比,缺失了tal2的M2、缺失了tal2和tal4的M3、仅含有tal1的M5以及tal-free的M6菌株,其在棉花上的致病力明显降低,而M1和M4突变体在棉花上的致病力没有明显变化,推测tal2和tal1基因在决定棉花角斑病症状中发挥重要作用。相应地,棉花子叶中细菌生长量测定结果发现,在接种后的第四天,突变体的生长量显著低于野生型,而突变体之间无显著性差异。按照同样策略,还对菜豆细菌性疫病菌（Xcp）和豇豆细菌性疫病菌（Xav）的tal基因进行了敲除,获得了tal基因部分敲除的突变体。棉花角斑病菌tal基因的成功敲除,为进一步揭示每个tal基因在棉花角斑病菌致病性中的作用机制奠定了较好的材料体系。3.四种黄单胞菌tal基因的分离和其在病原菌致病性中的作用为了说明tal基因是存在于黄单胞菌的染色体上还是质粒上,按照基因组DNA和质粒DNA两种提取方法,分别获得了基因组DNA和质粒DNA,经Bam HI酶切后,以tal基因的Sph I片段为探针进行Southern杂交,发现:菜豆细菌性疫病菌Xcp有2个tal基因,大豆斑疹病菌4个tal基因,豇豆细菌性疫病菌9个tal基因,而棉花角斑病菌有6个tal基因。前3个病菌的tal基因均位于染色体上,而棉花角斑病菌的6个tal基因均位于质粒上。根据Southern杂交tal基因杂交信号带位置,回收相应tal条带,构建在p B载体上,构建tal基因文库。以tal基因的Sph I片段为探针,进行菌落原位杂交,阳性克隆经Sph I酶切判断带谱类型和大小,获得目标tal基因阳性克隆。候选tal基因阳性克隆再经Southern杂交证实,获得了棉花角斑病菌的6个tal基因、豇豆细菌性疫病菌的4个tal基因、菜豆细菌性疫病菌的1个tal基因和大豆斑疹病菌的3个tal基因。鉴于tal基因中央有102 bp单元的多重复,为了测通序列,我们利用Tn5转座子对从棉花角斑病菌中分离获得的6个tal基因进行了插入,根据限制性内切酶酶切,选择Tn5插入在tal基因中间位置的tal基因进行测序。测序结果发现,棉花角斑病菌的6个tal基因在数据库中无相同基因;tal1基因有27.5重复单元,tal2有25.5个,tal3有21.5个,tal4有18.5个,tal5有15.5个和tal6有13.5个。为了评价每个tal基因在棉花角斑病菌致病性的贡献,6个tal基因分别克隆在表达载体p HM1上,经过酶切电泳和Western blot验证,构建成功。将6个tal构建分别转化tal-free的棉花角斑病菌M6突变体,获得了含有单个tal基因的棉花角斑病菌。经注射接种棉花叶,7天后发现,含有tal1和tal2的棉花角斑病菌导致注射区域的叶肉细胞坏死,显示坏死症状,其它tal基因不能使棉花叶肉细胞坏死。这说明,tal1和tal2在棉花角斑病菌致病性中起重要作用。4.棉花角斑病菌TALE蛋白在棉花中的靶标基因鉴定为了鉴定棉花角斑病菌TALE2蛋白在棉花中的靶标基因从而揭示TALE2的致害机理,将野生型Xss-V2-18、含有tal2基因的M6（M6-TALE2）和不含tal基因的M6菌株注射棉花叶,72 h后取注射区域的棉叶组织进行RNA-seq,获得转录表达谱。经过比较分析,选取tal2基因作用下的棉花上调表达基因的启动子,构建启动子库。根据TALE2蛋白的26个RVD,利用TALE target预测软件筛选启动子库,获得了11个候选启动子。表达和纯化TALE2蛋白,标记候选启动子为探针,通过EMSA试验证实,LOC107894299和LOC107911681基因可能是TALE2作用的靶标基因。为了证实此点,在LOC107894299和LOC107911681基因启动子区选择特定的DNA序列,人工合成分别作用于这两个基因启动子的d TALE,即d TALE1681和d TALE4299。将合成的d TALE基因构建在p HM1载体上,分别导入tal-free的M6菌株中,获得了M6-d TALE1681和M6-d TALE4299菌株,注射接种棉花子叶。五天后发现,M6-d TALE1681和M6-d TALE4299菌株能够像M6-TALE2一样,激发棉花产生水渍状症状。RT-PCR检测结果发现,LOC107911681在d TALE1681和TALE2作用下,其表达量明显高于野生型菌株Xss-V2-18以及M2和M6菌株。但LOC107894299的表达量的变化不明显。这提示,LOC107911681基因可能是TALE2的作用靶标。是否如此,还需要进一步试验验证。