论文部分内容阅读
研究背景:航天飞行时,人体暴露于失重环境中,将出现一系列适应性反应,如骨质丢失、骨骼肌萎缩、血容量少、心肌萎缩、血管结构与功能改变、视觉系统改变等[1-3]。动物实验显示,模拟失重时血管重塑主要表现为:前身动脉出现中膜肥厚,周围神经支配增强,收缩反应增强,而后身动脉出现中膜萎缩,周围神经支配减弱,收缩反应降低[4]。血管重塑是在轨及返回地面后航天员工作能力与身体健康的重要影响因素。颈总动脉(common carotid artery,CA)作为头部血供的主要来源,其结构与功能稳定对保持脑血流稳态有重要的作用[5,6]。颈总动脉内膜-中层厚度(carotid artery intima-media thickness,CIMT)增加是高血压、动脉粥样硬化等疾病导致心脑血管事件的独立危险因素[7-9]。航天飞行中的观察表明,6个月飞行使得航天员CIMT增加约12%,此变化在回到地面4天后仍存在[10];此外,飞行时长大于30天的航天员其CIMT显著大于无太空飞行经历的航天员[11]。动物实验也发现,4周(week,wk)模拟失重大鼠CA中膜平滑肌层数未变但CIMT显著增加[12-14]。虽经多年研究,目前,失重/模拟失重导致CIMT增加的机制尚不清楚。1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate,S1P)及其受体(sphingosine 1-phosphate receptors,S1PRs)是鞘脂代谢的重要成员,S1P由鞘氨醇(sphingosine,Sph)在鞘氨醇激酶(sphingosine kinase,SphK)的作用下磷酸化而生成,在心血管系统中可调控血管生长、内皮屏障完整、血管张力调节等过程。S1P可被1-磷酸鞘氨醇裂解酶(S1P lyase,SGPL1)不可逆降解为十六烯醛和磷酸乙醇胺。S1P受体(S1P receptors,S1PRs)共有5种亚型:S1PR1-5,属于G蛋白偶联受体,其中血管内皮细胞和平滑肌细胞上主要分布S1PR1-3[15]。S1PR1和S1PR3激活可促使内皮细胞产生一氧化氮(nitric oxide,NO),促进血管舒张,S1PR1也参与血管新生及成熟[16,17];S1PR2可抑制平滑肌细胞的迁移,S1PR2和S1PR3可使平滑肌细胞收缩,血管紧张度增加[18]。多种刺激因素,如激素、生长因子、趋化因子等均可激活SphK[19],使S1P产生增多,多种病理情况下S1PRs的数量也可发生改变[20]。S1P/S1PRs激活也是肺动脉高压血管重塑的重要介导机制。但失重/模拟失重时,CA中S1P/S1PRs如何改变?在CIMT变化中发挥何种作用?未有研究报道。实验目的:1.观察尾部悬吊模拟失重大鼠CA中S1P/S1PRs的变化。2.观察模拟失重大鼠胸主动脉(thoracic aorta,TA)和腹主动脉(abdominal arota,AA)中S1P/S1PRs的变化,其与CA变化的关系如何?模拟失重大鼠不同动脉S1P/S1PRs变化是否与跨壁压改变有关?3.探讨S1P/S1PRs在模拟失重大鼠CIMT变化中的作用及机制实验方法:1.采用尾部悬吊(tail suspended hindlimb unloading,HU)大鼠模型模拟失重时的血流动力学变化,悬吊时间为4 wk,到期后取材CA、TA和AA。2.通过苏木素-伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色观察动脉结构的变化,用Image Pro Plus/ImageJ软件测量动脉内膜-中层厚度(intima-media thickness,IMT)、横截面积(cross-sectional area,CSA)。3.通过免疫蛋白印迹(Western blotting,WB)和/或免疫组织化学染色(immunohistochemistry,IHC)染色,观察大鼠动脉调控S1P生成酶SphK1及SphK2、降解酶SGPL1以及S1PRs的表达和分布,同时观察增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、Caspase3、B细胞淋巴瘤-2蛋白(B-cell lymphoma-2,Bcl2)、1型胶原蛋白(collagen 1,COL1)表达。4.通过酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测大鼠动脉中S1P的含量。5.通过二氢乙啶(dihydroethidium,DHE)荧光探针染色观察动脉ROS水平。6.腹腔注射或离体孵育S1PR1功能性抑制剂芬戈莫德(fingolimod,FTY720),通过WB、IHC、DHE观察大鼠CIMT以及PCNA、Caspase3、Bcl2表达以及ROS水平变化。实验结果:1.4 wk尾部悬吊后大鼠CA的S1P/S1PRs变化与对照(control,CON)组相比,HU大鼠CA中SphK1(P<0.01)、SGPL1(P<0.05)表达显著减少,SphK2和S1PR1表达显著增加(P<0.05),S1PR2和S1PR3表达无明显变化。ELISA检测结果显示,4 wk尾部悬吊后大鼠CA中S1P含量显著减少(P<0.05)。2.4 wk尾部悬吊后大鼠TA和AA的S1P/S1PRs变化与CON相比,HU大鼠TA中SphK1、S1PRs表达无明显改变,而SphK2和SGPL1表达降低(P<0.05),ELISA检测结果显示,HU大鼠TA中S1P含量显著增加(P<0.05);同时,HU大鼠TA的IMT和CSA增加(P<0.05),PCNA表达显著增加(P<0.05),但COL1表达无明显变化。与CON相比,HU大鼠AA中SphK1、SphK2(P<0.05)、SGPL1(P<0.01)表达均显著增加,S1PR1(P<0.05)、S1PR3(P<0.01)表达显著降低,ELISA检测结果显示,HU大鼠AA中S1P含量显著降低(P<0.05)。同时,HU大鼠AA的IMT、CSA和PCNA表达无显著变化,但COL1表达显著减少(P<0.05)。此外,CON大鼠AA中SphK1、SphK2、SGPL1、S1PR3(P<0.01),PCNA、COL1(P<0.05)的蛋白表达均显著低于TA,IMT与CSA均小于TA(P<0.05)。3.CA中S1P/S1PRs在HU大鼠CIMT变化中的作用和机制腹腔注射FTY720(1 mg/kg/d,4 wk)后,与HU相比,HU+FTY720组大鼠CIMT显著减小(P<0.05),同时,PCNA(P<0.05)、Bcl2(P<0.01)表达降低,Caspase3表达增加(P<0.05),超氧阴离子含量显著降低(P<0.05),表明平滑肌细胞增殖水平降低,凋亡水平升高,氧化应激水平降低。与CON相比,CON+FTY720组大鼠CIMT显著增大(P<0.05),PCNA表达增加(P<0.01),Caspase3(P<0.01)、Bcl2(P<0.05)表达降低,超氧阴离子含量显著增多(P<0.05),表明平滑肌细胞增殖水平升高,凋亡水平可能降低,氧化应激水平增高。研究结论:1.模拟失重大鼠CA、TA和AA的S1P/S1PRs发生明显的部位性差异改变,其中CA的S1P/S1PRs参与了HU大鼠CIMT变化过程。2.模拟失重大鼠颈总动脉CIMT变化伴随平滑肌细胞增殖和凋亡以及氧化应激水平的改变,CA的S1P/S1PRs也参与这些变化过程。3.模拟失重大鼠大血管S1P/S1PRs的变化并不完全与跨壁压改变一致,例如,HU大鼠CA、AA中S1P的含量均降低,但前者跨壁压升高,后者跨壁压减小。4.正常大鼠大动脉间S1P/S1PRs通路蛋白表达存在明显差异,如正常大鼠TA中SphK1、SphK2、SGPL1、S1PR3表达均高于AA。