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研究目的:常染色体显性多囊肾病(autosomal dominant kidney disease,ADPKD)作为最常见的遗传性肾病,主要由PKD1或PKD2基因突变引起,导致肾脏囊肿的形成和扩张。过去的40多年,ADPKD的进展、诊断和治疗已取得巨大的进步,但是ADPKD目前仍是难以治愈的疾病,缺少有效的干预及治疗手段。ADPKD作为常见的遗传性肾病,基因突变是探索疾病本身发生发展机制的核心。PKD1或PKD2基因突变可导致一系列的信号转导通路发生异常,异常激活或抑制的信号通路相互交联,形成复杂的网络系统。通过对2项ADPKD患者肾组织表达谱芯片数据集进行生物信息学分析,发现核心节点基因DCN在多囊肾病中是异常表达,与多种差异表达基因存在生物学关联,参与多种信号转导通路。DCN基因编码蛋白核心蛋白聚糖(decorin,DCN)是细胞外基质的成分之一,属于富含亮氨酸的小分子多糖家族成员,通过多种机制发挥抗肿瘤,调节新生血管形成、抗纤维化等生物学功能。DCN蛋白作为具有广泛生物学效应的小分子蛋白,在慢性肾脏病进展中起到抗炎和抗纤维化的作用。深入探索DCN在ADPKD中的生物学功能,可能为预防和治疗ADPKD提供新的研究方向和靶点。研究方法:(1)检索NCBI-GEO数据库,获取ADPKD患者的表达谱芯片数据集GSE7869和GSE35831,进行完整的生物信息学分析。从两个数据库中分别提取差异基因(different expression genes,DEGs)取交集,将共同的DEGs进行功能和信号通路富集,根据蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)分析与计算,获取节点基因。利用早期诱导多囊肾病小鼠肾组织及ADPKD患者肾脏组织,在mRNA水平验证6个DEGs。确认DCN基因作为核心节点基因在多囊肾中的异常表达。(2)利用多囊肾病不同生物模型(Pkd2-MO斑马鱼,早期和晚期诱导多囊肾病小鼠模型),在mRNA和蛋白水平探寻DCN的表达变化,分析在多囊肾病不同发展阶段DCN的异常表达情况。(3)利用单细胞RNA测序技术及晚期诱导多囊肾病小鼠进展期模型,明确DCN基因在不同肾脏细胞中的定位及表达情况,探索DCN基因在多囊肾病中可能的生物学功能。(4)体外培养囊肿衬里上皮细胞,利用RNA干扰技术,明确DCN基因对囊肿衬里上皮细胞(cystic line epithelial cells,CLECs)生长的调节作用,探索DCN调控CLECs生长的相关机制。研究结果:(1)对ADPKD患者GSE7869和GSE35831表达谱芯片数据集进行生物信息学分析,发现561个差异表达基因,通过对DEGs编码蛋白的PPI分析,分析获取排名前十的核心节点基因。利用早期诱导多囊肾病小鼠肾组织及ADPKD患者肾脏组织,在mRNA水平确认6个DEGs mRNA的表达,明确DCN基因作为核心节点基因在多囊肾进展阶段的异常高表达。(2)观察到多囊肾病的不同发展阶段DCN基因及其编码蛋白DCN异常表达。应用定量PCR、蛋白免疫印记及免疫组化检测出,在多囊肾病的Pkd2-MO斑马鱼模型中,与阴性对照相比较,在多囊肾发生阶段DCN基因及其编码的核心蛋白聚糖均呈现低表达。而在早期诱导小鼠及晚期诱导多囊肾病小鼠肾囊肿发展阶段及ADPKD的终末期肾脏病患者的肾组织中,DCN基因及编码的核心蛋白聚糖呈现高表达;免疫组化显示DCN主要分布在CLECs及肾组织间质,提示DCN蛋白在肾脏囊肿的发生发展不同阶段期表达水平存在差异。可以明确的是在ADPKD的进展阶段,多囊肾病组织中DCN的表达是升高的。(3)单细胞RNA测序结果显示,在多囊肾病进展期小鼠的肾组织中Dcn基因在部分近端小管上皮细胞及T淋巴细胞呈现较高水平的表达。同时在全部肾脏细胞中Dcn的相对表达量与细胞周期调控基因Mcm2和Pcna的表达呈现正相关,与细胞细胞凋亡调控基因Bcl2的表达呈现负相关,提示DCN基因参与CLECs生长的调控。(4)体外实验,应用RNA干扰技术,敲低DCN基因在CLECs的表达后,流式细胞周期检测发现CLECs的细胞周期阻滞在G2/M期,同时凋亡增加,MTT生长曲线证实CLECs增殖减弱,细胞核Edu染色显示处于复制期的DNA减少,提示抑制DCN的表达可以抑制CLECs增殖,促进CLECs凋亡。DCN-siRNA干扰的CLECs细胞TNF-α和MCP-1的合成是减少的,提示DCN参与CLECs炎症反应。研究结论:(1)ADPKD表达谱的生物信息学分析可以为ADPKD的基础研究提供新的研究方向与靶点。我们选取具有广泛生物学效应的DCN基因作为研究对象。(2)DCN基因及其编码蛋白在多囊肾病发生发展的不同阶段呈现不同的表达。可以明确在ADPKD的进展阶段,多囊肾病组织中DCN的表达是升高的。(3)单细胞RNA测序结果显示,在多囊肾病的进展阶段,在已检测到的肾脏细胞中,DCN的相对表达量与调控细胞周期和细胞凋亡的基因具有相关性。(4)体外实验证实,DCN基因通过影响Akt的磷酸化,参与调控细胞生长。总之,DCN蛋白可以为预防和治疗ADPKD提供新的研究方向和治疗靶点。