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随着纳米技术的迅猛发展,金属纳米颗粒已在各领域广泛运用,纳米二氧化钛（TiO2）是人们使用最多的金属纳米颗粒之一,年生产量达10000?吨。纳米TiO2的大量生产和应用导致其不可避免地进入环境中,其对生物体和生态系统引起的毒性效应及安全性问题受到广泛关注。本研究在探讨纳米TiO2致炎效应及作用机制的基础上,结合有害物质健康损伤化学预防的理念,对课题组合成的青蒿琥酯磷脂二倍体（Di-ART-GPC）脂质体的抗炎疗效进行评价,并应用其干预纳米TiO2的致炎过程,观察Di-ART-GPC脂质体对纳米TiO2致炎效应的影响,探索Di-ART-GPC脂质体用于预防或减轻纳米TiO2环境暴露危害的潜力,为深入开展纳米TiO2的毒性效应及应用安全性研究提供依据。本研究工作主要包括以下三个部分:一、纳米TiO2对细胞炎症因子表达的影响及其作用机制目的:探讨纳米TiO2的致炎效应及作用机制,以了解纳米TiO2在生物体内的毒性和作用机制,为评估其所构成的环境风险提供实验室数据支持。方法:应用透射电镜（Transmission electron microscope,TEM）观察纳米TiO2颗粒的形状,采用动态光散射法（Dynamic light scattering,DLS）测定TiO2纳米颗粒的平均水合粒径、分散系数及Zeta电位;CCK8法测定纳米TiO2对靶细胞RAW264.7细胞增殖活性的影响,ELISA法测定不同浓度纳米TiO2对RAW264.7细胞炎性因子表达水平的影响;采用Western Blot法测定不同浓度纳米TiO2对MAPK信号通路中p-ERK、ERK、p-JNK、JNK、p-p38及p38等蛋白表达的影响。结果:透射电镜（TEM）观察结果显示,分散于DMEM完全培养液中的纳米TiO2颗粒呈球形,可见部分颗粒团聚;动态光散射（DLS）法检测结果显示,纳米TiO2颗粒的平均水合粒径为74.10±0.21 nm,分散系数（PDI）为0.14±0.04,Zeta电位为-28.87±0.42m V;CCK8结果显示,5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL纳米TiO2染毒靶细胞RAW264.7对其细胞增殖活性无明显影响（细胞增殖率>80%）,40μg/mL纳米TiO2染毒则会使细胞增殖率低于80%;ELISA结果表明,与对照组相比,经10μg/mL及20μg/mL纳米TiO2处理的RAW264.7细胞炎性因子TNF-α、IL-1β及IL-6表达水平增加（P<0.05）;Western Blot结果表明,与对照组相比,10μg/mL及20μg/mL的纳米TiO2处理可使细胞p-ERK、p-JNK、p-p38等磷酸化蛋白表达水平升高（P<0.05）,蛋白灰度值比值p-ERK/ERK、p-JNK/JNK以及p-p38/p38升高（P<0.05）。二、Di-ART-GPC脂质体的抗炎作用评价目的:对课题组前期制备的新型Di-ART-GPC脂质体抗炎效果进行评价,并在动物炎症模型中初步验证,同时对Di-ART-GPC脂质体的全身毒性进行初步安全性评价,为Di-ART-GPC脂质体化学预防的抗炎应用基础研究提供实验依据。方法:应用CCK8法测定Di-ART-GPC脂质体对靶细胞RAW264.7的体外细胞毒性,用脂多糖（LPS）诱导的炎症细胞模型研究其对RAW264.7细胞的体外抗炎效果;通过构建弗氏完全佐剂（FCA）诱导的大鼠关节炎模型验证Di-ART-GPC脂质体对大鼠的体内抗炎疗效;采用家兔血管刺激试验及豚鼠全身主动过敏试验对Di-ART-GPC脂质体的全身毒性进行初步安全性评价。结果:CCK8结果显示,在0.625、1.25、2.5、5、10、20μg/mL浓度条件下,Di-ART-GPC脂质体分别体处理细胞6h、12h、24h后,细胞增殖率均高于相同浓度的ART处理的细胞（P<0.05）;ELISA结果显示,1.25μg/mL Di-ART-GPC脂质体可抑制LPS诱导的NO、TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子的表达上调（P<0.05）,且抑制程度优于相同浓度下的前体药物ART。关节炎大鼠体内实验结果证实,3.0mg/kg及6.0mg/kg的Di-ART-GPC脂质体治疗可降低大鼠踝关节肿胀度（P<0.05）,下调大鼠血清中炎性因子TNF-α、IL-6的表达（P<0.05）,改善关节炎大鼠的炎症反应,且6.0mg/kg剂量下抗炎效果优于2.4mg/kg的前体药物ART;家兔血管刺激性试验和豚鼠全身主动过敏试验结果表明,6.0 mg/kg的Di-ART-GPC脂质体对家兔血管无刺激性、对豚鼠无过敏性。三、MAPK信号通路在Di-ART-GPC脂质体影响纳米TiO2致炎效应中的作用目的:观察Di-ART-GPC脂质体对纳米TiO2致炎效应的影响及其作用机制,探索Di-ART-GPC脂质体在抑制纳米TiO2炎性损伤方面的应用潜力。方法:应用ELISA法测定不同浓度Di-ART-GPC脂质体对纳米TiO2上调的RAW264.7细胞炎性因子表达的影响;采用Western Blot法测定Di-ART-GPC脂质体对纳米TiO2干预后MAPK信号通路中p-ERK、ERK、p-JNK、JNK、p-p38及p38等蛋白表达的影响。结果:ELISA结果表明,1.25μg/mL及2.5μg/mL的Di-ART-GPC脂质体均可抑制纳米TiO2诱导的炎性因子表达升高（P<0.05）;Western Blot结果表明,与纳米TiO2处理组相比,1.25μg/mL Di-ART-GPC脂质体干预后,蛋白灰度值比值p-JNK/JNK降低（P<0.05）;2.5μg/mL Di-ART-GPC脂质体干预后,蛋白灰度值比值p-ERK/ERK、p-JNK/JNK、p-p38/p38均降低（P<0.05）。四、初步结论1.纳米TiO2的细胞毒性较低,20μg/mL及以下浓度的纳米TiO2对RAW264.7细胞增殖活性无明显影响。10μg/mL及20μg/mL的纳米TiO2可上调细胞TNF-α、IL-1β及IL-6的表达水平,同时使RAW264.7细胞蛋白灰度值比值p-ERK/ERK、p-JNK/JNK以及p-p38/p38升高。纳米TiO2的致炎机制之一可能是通过ERK/JNK/p38 MAPK信号通路诱导TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子的产生从而引发炎性损伤。2.Di-ART-GPC脂质体作为一种新型的青蒿素衍生物,与临床使用的ART相比,相同剂量下具有相对较低的细胞毒性,在LPS诱导的细胞炎症模型和FCA诱导的大鼠关节炎模型中均显示出良好的抗炎效果,且对家兔无血管刺激性、对豚鼠无过敏性,初步显示出了其作为潜在抗炎化合物良好的生物安全性。3.Di-ART-GPC脂质体干预可抑制纳米TiO2诱导的炎症因子的表达上调,还可抑制纳米TiO2诱导的细胞p-ERK、p-JNK、p-p38等磷酸化蛋白表达上调,Di-ART-GPC脂质体可能通过抑制ERK/JNK/p38 MAPK信号通路的激活来发挥对纳米TiO2致炎损伤的抑制作用。