民族药地椒(Thymus quinquecostatus Celak)为百里香属(Thymus)植物地椒的地上部分,主要分布于宁夏、内蒙古、陕西,青海、甘肃等地,具有清热解毒和抗肿瘤的功效。目前地椒的研究多集中于挥发油成分的研究,但是不同产地地椒挥发油的化学组成及其抗癌药理活性、地椒非挥发部位化学成分及其生物活性研究,以及相关质量评价标准研究基本处于空白。鉴于以上情况,本论文主要开展以下几部分工作:第一部分 文献综述本论文查阅了 55篇国内外百里香属植物研究资料,对百里香属植物挥发油、化学成分、药理活性及百里香属植物的种植资源与开发利用等国内外研究文献进行查阅综述,为百里香属植物的进一步研究与开发提供参考;对植物地椒化学成分、生物活性及其在民间和临床方面的研究与应用进行综述,为地椒的进一步研究和开发提供参考。第二部分 地椒挥发油化学成分与生物活性研究地椒挥发油抗癌细胞、抗氧化活性研究表明,其对BGC-823和HepG2细胞有显著抑制作用。地椒挥发油DPPH、ABTS自由基清除实验显示,地椒挥发油样品具有显著的清除自由基活性。其中地椒(庆阳和靖边产区)挥发油抗癌细胞活性优于地椒(榆林与隆德产区)挥发油活性;DPPH自由基清除活性依次为地椒(榆林)>地椒(靖边)>地椒(庆阳)>地椒(隆德);ABTS自由基清除活性由强至弱依次为地椒(庆阳)>地椒(榆林)>地椒(靖边),地椒(隆德产区)挥发油无活性。地椒挥发油化学成分主要为芳香类成分,且分子中多含有酚羟基,但榆林、靖边、庆阳、隆德四个主产区地椒挥发油化学成分种类和含量差异显著,仅1,8-cineole(1,8-桉叶素,1.84%-10.6%),linalool(芳樟醇,1.22%-12.8%),terpinen-4-ol(4-萜烯醇,1.03%-10.56%)和γ-terpinene(γ-松油烯,0.15%-11.11%)为四产区地椒共有成分。其中γ-terpinene在两地含量差异高达100倍之多,说明不同产区地椒挥发油化学成分的种类及含量之间存在较大的差异。第三部分 地椒非挥发部位化学成分与生物活性研究对地椒非挥发部位化学成分进行研究,分离鉴定出13个化合物,其中包括7个黄酮类化合物,4个酚酸类化合物。其中黄酮类化合物5,6-二羟基-4’-甲氧基-7-O-正戊基黄酮为新化合物,该化合物是首次发现的五碳烷烃醚化黄酮的新骨架化合物,分子中的五碳烷氧基侧链改变了该化合物的极性和溶解性,有效的提高了其成药可能性。黄酮化合物还有灯盏乙素(野黄芩苷)、野黄芩素、木犀草苷、木犀草素、芹菜素和芦丁。酚酸类成分包括绿原酸、香草酸、丹参素,原儿茶酸,其余两个为齐墩果酸和胡萝卜苷。其中5,6-二羟基-4’-甲氧基-7-O-正戊基黄酮,灯盏乙素(野黄芩苷)、野黄芩素、芦丁、绿原酸、香草酸、丹参素等7个化合物为首次从该属分离得到,全部化合物均为首次从地椒植物中分离得到。地椒非挥发部位不同极性部位抑制胃癌BGC-823细胞活性研究表明,地椒石油醚部位、正丁醇部位和乙酸乙酯部位对人胃癌BGC-823细胞均有显著地抑制作用。不同极性五部分抑制细胞增殖活性IC 5 0大小依次为石油醚部位>正丁醇部位≈乙酸乙酯部位>氯仿部位>水部位;地椒不同部位DPPH自由基清除能力活性顺序依次为乙酸乙酯部位>正丁醇部位>氯仿部位>石油醚部位>水部位;地椒不同极性部位ABTS自由基清除能力中,正丁醇部位和乙酸乙酯部位最大。上述研究结果表明地椒具有显著的抗癌细胞活性与自由基清除活性,且二者在地椒不同极性部位活性顺序具有关联,其中乙酸乙酯部位是地椒发挥抗癌与抗氧化能力的活性部位。鉴于前期抗氧化和肿瘤活性研究结果的一致性,以抗氧化为指标,采用响应面分析法得到具有最佳抗氧化功效的地椒醇提取条件,DPPH=0.093-0.008X1-0.01X2+0.0007X3-0.003X1X2-0.0003X1X3+0.006X2X3-0.014X12-0.02X22-0.016X32拟合状况良好,能够精确的预测实验的实际结果,其校正系数R2=0.8396,可以用来解释83.96%的试验数据变异性,实验信噪比为9.289,表明有较强的信号。实验得出,乙醇浓度为45%左右,料液比为20:1,提取时间1.5 h时,地椒提取物的抗氧化能力最高。建立了地椒中六个成分丹参素、香草酸、绿原酸、木犀草苷、灯盏乙素、芹菜素的HPLC 定量分析方法。六个成分分别在 4.68-150.0 μg/mL,0.4-12.9 μg/mL,6.25-100.0 μg/mL,1.25-20.0 μg/mL,6.25-200.0 μg/mL,0.625-20.0μg/mL 范围内线性关系良好。六个成分加样回收率均在95%-105%范围内,RSD值均小于2%,所建方法简便,准确,稳定,可行,可作为地椒中化合物含量测定方法。对不同采收期地椒进行了初步质量评价研究,结果表明地椒中灯盏乙素含量最高可达0.78%。灯盏细辛(贵州和四川产区)中灯盏乙素含量一般在0.3-0.5%左右,该研究结果提示地椒可作为制备灯盏乙素的新药用植物资源。第四部分 地椒抑制癌细胞增殖活性协同作用研究鉴于地椒挥发油部位与其乙酸乙酯部位表现出的较好的抗癌活性,探究地椒两部分发挥抗癌活性的协同作用。结果显示两部位混合后可显著提高对BGC-823细胞的抑制率,当乙酸乙酯(mg):挥发油(μL)=20.16:60,给药浓度100μg/μL时,其抑制率可达92.24%,说明地椒发挥药效作用是多部分协同作用的结果。通过对地椒挥发油与地椒醇提物化学成分与生物活性的研究,对地椒生物活性进行评价,阐述地椒挥发油化学成分种类和含量与其产地间的关系,对地椒抗癌药效成分进行初步阐明,建立地椒质量控制方法,并对不同采收期地椒质量进行研究。第五部分 总结与讨论创新点:1 首次对地椒化学成分进行分离鉴定,分离鉴定出13个化合物,其中黄酮类化合物7个,分别为5,6-二羟基-4’-甲氧基-7-O-正戊基黄酮、灯盏乙素、野黄芩素、木犀草苷、木犀草素、芹菜素、芦丁;酚酸类成分4个,分别为绿原酸、香草酸、丹参素,原儿茶酸;其余成分2个,为齐墩果酸和胡萝卜苷。首次发现五碳烷烃醚化新黄酮类化合物5,6-二羟基-4’-甲氧基-7-O-正戊基黄酮。该化合物的戊氧基侧链取代改变溶解性的新结构为黄酮类化合物新药开发提供了思路。5,6-二羟基-4’-甲氧基-7-O-正戊基黄酮,灯盏乙素(野黄芩苷)、野黄芩素、芦丁、绿原酸、香草酸、丹参素为首次从该属分离得到,全部化合物均为首次从地椒中分离得到。2 首次对不同产地地椒挥发油化学成分与生物活性进行了对比分析研究。3 首次对地椒不同萃取部位抗癌活性与抗氧化活性进行了筛选研究。4 首次建立了最优抗氧化活性地椒提取物的提取方法。5 首次建立HPLC同时测定地椒中丹参素、香草酸、绿原酸、木犀草苷、灯盏乙素、芹菜素6种成分的含量测定方法,为全面的、准确的评价地椒质量提供了一定的基础。6 首次以灯盏乙素作为指标成分,探讨灯盏乙素在不同采收期地椒中含量变化趋势。7 首次研究地椒不同活性部位协同抗癌活性。