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喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤,在我国占头颈部肿瘤的13.9%。喉癌的治疗目前多采用以手术为主、联合放化疗的综合治疗,在最大程度根除肿瘤的基础上保全喉的功能,在保证患者的生存率的同时提高生存质量。但手术后复发和转移仍是喉癌的主要致死原因,而且放疗和化疗毒副作用较大。因此,寻找新的安全、有效、毒副作用小的治疗方法成了关注的焦点。细胞增殖和细胞凋亡失常在肿瘤的发生、发展过程中普遍存在的现象已经得到研究人员的共识。Bcl-2基因是一原癌基因,其高表达可引起肿瘤发生,而且它能够明显延长细胞的生存,是目前公认的比较重要的细胞凋亡调控基因。Survivin是新近发现的IAP家族成员,在人类常见的肿瘤组织中呈现高表达。Bcl-2和survivin基因在喉癌组织中均呈现高度表达,而且其表达与组织病理的分化程度降低、临床分期的增加、淋巴结转移的出现呈正相关。由于肿瘤是一种多基因参加,多步骤与多阶段的疾病,因此针对上述两个基因靶点的联合治疗可能会起到更好地效果。近年来RNA干扰技术被应用于恶性肿瘤基因治疗的试验研究中。它通过小干扰RNA与目的癌基因的mRNA按照碱基互补的原理特异性结合,干扰目的基因的翻译、转录和蛋白质形成的功能,阻止目的蛋白生成,诱导癌细胞凋亡或向成熟方向分化,进而达到抑制肿瘤生长的目的。紫杉醇是近年来发现的一种新型的、具有广谱高效抗癌活性的药物。已有多个临床研究证实紫杉醇在头颈部鳞状细胞癌治疗中具有较好的效果。因此本研究把bcl-2、survivin基因和紫杉醇作为生物化疗联合应用研究的靶点,利用RNAi技术研究将两种基因同时沉默并联合紫杉醇诱导观察其对喉癌Hep-2细胞的影响,探究其相互作用的机制,为肿瘤治疗寻找新的安全有效的途径。研究目的：(1)构建bcl-2 shRNA及survivin shRNA慢病毒表达载体,探讨利用RNAi技术沉默喉癌Hep-2细胞中bcl-2和survivin基因后,细胞中相应目的基因的表达情况。(2)观察bcl-2和survivin基因沉默后对喉癌Hep-2细胞生长的影响及细胞周期的影响。(3)探讨共转染bcl-2 shRNA及survivin shRNA后Hep-2细胞中相应目的基因的表达情况及对Hep-2细胞增殖的影响。(4)阐明共转染bcl-2、survivin基因shRNA对Taxol诱导的Hep-2细胞凋亡的影响。研究方法：(1)根据siRNA设计原则构建bcl-2 shRNA及survivin shRNA慢病毒表达载体。(2)采用RT-PCR方法检测shRNA转染后对喉癌Hep-2细胞中bcl-2和survivin基因mRNA水平的影响。(3)用Western blot方法检测shRNA转染以及转染联合紫杉醇诱导后对Hep-2细胞中bcl-2和survivin蛋白水平的影响。(4)免疫荧光细胞化学法检测shRNA转染及紫杉醇诱导后Hep-2细胞的形态变化及目的基因的表达情况。(5)用CCK-8法检测bcl-2 shRNA及survivin shRNA单独转染、共转染及其联合紫杉醇诱导后对Hep-2细胞增殖的影响。(6)用流式细胞仪检测转染bcl-2 shRNA、survivin shRNA及shRNA转染联合紫杉醇诱导后对Hep-2细胞周期的影响。(7)用caspase3舌性检测试剂盒检测共转染bcl-2 shRNA、survivin shRNA对紫杉醇诱导的Hep-2中caspase3的活性。(8)应用SPSS19.0统计软件进行统计学处理,统计学数据用均数±标准差(x±s)表示,对计量资料,多个样本均数比较应用单因素方差分析及重复测量资料的方差分析,两样本均数比较采用t检验。检验水准P<0.05。结果(1)利用RNAi技术成功的构建了Survivin和Bcl-2基因的shRNA慢病毒表达载体,并成功转染喉癌Hep-2细胞,转染后目的基因的siRNA在细胞中稳定表达。(2)Bcl-2和survivin siRNA干扰喉癌Hep-2细胞后,单独转染组细胞中相应沉默的基因的mRNA表达减少(P<0.01),共转染组较单独转染组减少显著(P<0.01)。(3)Western blot显示转染组细胞内目的蛋白表达减少(P<0.01),共转染组细胞中较单独转染组显著减少(P<0.01)。加入紫杉醇后各组细胞中目的蛋白均比未加紫杉醇组细胞中表达明显减少(P<0.05),且转染联合组中目的蛋白的表达较加入紫杉醇前明显减少(P<0.01)。(4)免疫荧光细胞化学法检测结果显示在激光扫描共聚焦显微镜下可见转染组中相应基因的表达减弱,且转染细胞出现凋亡的形态学改变。紫杉醇作用后细胞形态出现明显的凋亡小体,且凋亡细胞内目的基因表达减少。(5)Bcl-2和survivin siRNA分别干扰喉癌Hep-2细胞后,可以明显抑制其增殖(P<0.05),共转染组较单独转染组抑制作用更明显(P<0.05),而且发现在转染48h时各转染组对细胞增殖的抑制作用稳定且高效。(6)Bcl-2和survivin siRNA干扰喉癌Hep-2细胞,可以影响其细胞周期。沉默bcl-2基因后出现S期阻滞；沉默survivin后导致由G1期进入S期细胞减少,出现了G0/G1期阻滞,从而抑制了细胞增殖。(7)紫杉醇诱导喉Hep-2细胞24h和48h细胞生长均被显著抑制(P<0.05和P<0.01),但两个时间点上对细胞生长的抑制无明显差别(P>0.05)(8)通过转染联合紫杉醇作用的三个时间点上来检测对细胞增殖的影响,发现转染24h时加入紫杉醇联合诱导24h,此时对细胞生长的抑制效果最显著(P<0.05),优于单独转染组及紫杉醇作用组(P<0.05)。(9)Bcl-2和survivin siRNA干扰喉癌Hep-2细胞后,caspase3活性显著增强(P<0.01),且共转染组较单独转染组明显(P<0.05)。联合紫杉醇作用后其活性较单独作用时明显(P<0.05),尤其是转染survivin siRNA联合紫杉醇组更明显(P<0.01)。(10)紫杉醇诱导细胞出现了G2/M期阻滞。转染pshRNA-Survivin联合紫杉醇诱导后,G2/M期细胞阻滞较单独紫杉醇作用更明显。Survivin基因沉默后增强了紫杉醇对细胞周期G2/M期的阻滞作用。结论(1)利用RNAi技术成功的构建了Survivin和Bcl-2基因的shRNA慢病毒表达载体,并成功转染喉癌Hep-2细胞,转染后目的基因siRNA在细胞中稳定表达。(2)Survivin和Bcl-2 shRNA可有效沉默喉癌Hep-2细胞中的Survivin和Bcl-2基因,下调其蛋白及mRNA的表达水平,且二者共转染后两种基因的表达的均减少,且较单独沉默时更明显。并且两种基因沉默后明显地抑制了Hep-2细胞的增殖,增强了caspase3的活性,且同时沉默时作用更显著,这两种基因可协同促进细胞的凋亡。(3)紫杉醇诱导Hep-2细胞后可明显抑制细胞增殖,有效增强caspase3的活性,而且细胞中bcl-2和survivin蛋白表达明显减少,紫杉醇抑制了两种抗凋亡基因的表达。(4)共转染Survivin和Bcl-2 shRNA与紫杉醇联合诱导Hep-2细胞,共沉默的基因可明显提高紫杉醇抗肿瘤细胞增殖的效果,并可协同其细胞周期阻滞及促进细胞凋亡,增强抗肿瘤作用的疗效。