东南景天耐镉相关基因SaLRR的克隆与功能初步分析

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东南景天(Sedum alfredii Hance)是我国本土发现的Zn/Cd超积累植物,能有效减轻重金属污染,是实施植物修复与生态绿化的优良植物。在本研究中,利用生物信息学、实时荧光定量PCR、亚细胞定位和转基因等技术,通过对东南景天中亮氨酸富集蛋白基因的克隆、生物信息学分析以及初步的耐镉性功能鉴定等方面的研究分析了亮氨酸富集蛋白基因的结构和功能,为阐明东南景天耐镉反应机制和林木耐镉转基因育种提供了物质(基因)基础和理论依据。主要研究内容及实验结果如下:1)采用PCR技术对亮氨酸富集蛋白(Leucine Rich Repeat,LRR)基因cDNA序列和基因组全长序列进行克隆,命名为SaLRR,结果显示cDNA全长1253bp,开放阅读框含1107bp,共编码368个氨基酸,基因组全长1132bp,无内含子序列,通过生物信息学软件对东南景天SaLRR基因编码的氨基酸序列进行分析。2)用400μmol·L-1的氯化镉(CdCl2)胁迫东南景天无性系水培植株,分别提取不同胁迫时间下根、茎、叶总RNA,反转录合成cDNA,利用实时荧光定量PCR分析SaLRR基因的表达模式,结果显示,SaLRR基因在东南景天根和茎中胁迫12h表达量最高,在叶中胁迫6h表达量最高,推测该基因可能为前期响应蛋白。3)通过构建原核表达载体pYES2.1,转化大肠杆菌并绘制CdCl2胁迫下大肠杆菌的生长反应曲线。研究发现,在0.8mM CdCl2胁迫条件下含有SaLRR基因的大肠杆菌能正常生长并很快达到对数期,而空载转化子基本不生长,说明SaLRR基因的表达提高了大肠杆菌的耐镉性。4)将插入片段构建到植物超表达载体pCAM2300-35S-Ocs中,通过浸花法转化拟南芥,检测分析证明SaLRR基因已成功插入到拟南芥的基因组中,测定转基因拟南芥的生理生化指标(SOD、POD、chla/b及电导率),分析结果显示,转基因拟南芥较之于野生型拟南芥具更高的镉耐受性。
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