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目的:本研究利用多次退火环状循环扩增(MALBAC)技术和高通量测序(NGS)技术对人类D5/D6胚胎培养液中的基因组DNA进行检测,并与其对应的囊胚遗传信息对比,从而验证无创染色体筛查(NICS)技术的灵敏度和特异度,为NICS技术的临床应用提供参考数据。方法:选取天津医科大学总医院生殖中心行ICSI助孕治疗并同意将新鲜或冻存的ICSI胚胎捐献用于科研的D2/D3胚胎。收集D5/D6形成3CC及以上的囊胚,经激光打孔囊胚皱缩后,收集成囊前24小时的培养液,通过MALBAC-NGS技术检测(1)培养液染色体非整倍体性及50 Mb以上的缺失和重复情况,并与其对应囊胚的染色体结果进行对比;(2)培养液和囊胚线粒体DNA拷贝数情况,并对其进行分析比较。同时吸取30μL培养液原液和恒温箱平衡24小时的培养液为空白对照和阴性对照。结果:1、材料来源:实验共纳入26对样本,其中15枚囊胚为新鲜胚胎,11枚为解冻后胚胎;D5囊胚8枚,D6囊胚18枚。2、实验成功率:26枚囊胚通过全基因组扩增技术和高通量测序技术均获得遗传信息,实验成功率为100%(26/26)。26个培养液样本中有3个检测失败,实验成功率为88.5%(23/26)。其中,4枚囊胚未行激光打孔,3枚培养液检测失败,失败率为75.0%(3/4);22枚囊胚行激光打孔,培养液均检测成功,实验成功率为100%(22/22)。3、囊胚染色体情况:(1)26枚囊胚中15枚染色体正常,4枚存在染色体数目或结构异常,染色体正常率为57.7%(15/26);7枚存在嵌合情况,嵌合体率为26.9%(7/26)。(2)D5囊胚中6枚染色体数目和结构正常,1枚染色体数目异常,染色体正常率为75.0%(6/8);1枚为嵌合体,嵌合体率12.5%(1/8)。D6囊胚中9枚正常,3枚染色体异常,染色体正常率为50%(9/18);6枚嵌合体,嵌合体率为33.3%(6/18)。(3)解冻后囊胚11枚,染色体正常5枚,异常2枚,染色体正常率45.5%(5/11);嵌合体4枚,嵌合体率36.4%(4/11)。新鲜囊胚15枚,染色体正常10枚,2枚染色体数目异常,染色体正常率为66.7%(10/15);3枚为嵌合体,嵌合体率为20.0%(3/15)。4、NICS与囊胚染色体结果对比分析:(1)23枚NICS结果中9枚为嵌合体,嵌合体率39.1%(9/23),高于囊胚26.9%的嵌合体率,未纳入后续比较分析。(2)剩余14枚囊胚中11枚染色体正常或变异程度小于可检测范围,其中8枚NICS结果与其一致,3枚假阳性结果,其特异度为72.7%(8/11),假阳性率为27.3%(3/11)。(3)3枚染色体异常的囊胚中2枚NICS结果提示染色体存在数目或结构异常,1枚假阴性结果,灵敏度为66.7%(2/3),假阴性率为33.3%(1/3)。(4)NICS技术阳性预测值为40.0%(2/5),阴性预测值为88.9%(8/9)。5、线粒体DNA拷贝数情况:(1)22枚囊胚及其培养液行线粒体DNA拷贝数检测,均检测成功,实验成功率为100%。其中,细胞线粒体DNA拷贝数为86-2495,培养液线粒体DNA拷贝数为20-435。(2)将22枚囊胚线粒体DNA拷贝数与培养时间(D5/D6)、是否冷冻、染色体整倍体情况及女方年龄进行比较,无明显相关性。(3)将22对样本的细胞与培养液中线粒体DNA拷贝数进行比较,呈正相关性。结论:1、胚胎培养液中含有胚胎所释放的游离DNA,通过激光打孔囊腔皱缩可提高培养液中游离DNA含量。2、通过全基因组扩增技术和高通量测序技术可对培养液中的游离DNA进行遗传学检测和分析,预测其胚胎遗传信息,提供一种无创胚胎植入前遗传学筛查技术。3、NICS技术可避免传统PGS技术的有创性,减少PGS技术引起的长期安全性问题,但其目前灵敏度和特异度较低,嵌合体率较高,仍需进一步实验验证。4、培养液中含有胚胎所释放的游离线粒体DNA,含量与胚胎线粒体DNA拷贝数呈正相关性。5、胚胎染色体异常是导致体外受精-胚胎移植技术失败的重要原因,即使是D5/D6发育至囊胚的胚胎仍存在较高比例的染色体数目、结构异常或嵌合情况。