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目的:支气管哮喘是以慢性气道炎症为特征的异质性疾病,具有显著的发病率和死亡率。上皮损伤在哮喘的发病机制中起着至关重要的作用,上皮细胞激活可以促进Th2免疫应答,分泌一系列细胞因子,释放大量炎症细胞,如嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞,这些炎性细胞在气道内聚集、激活导致上皮进一步损伤,释放大量的氧自由基,造成氧化应激。上皮损伤激活上皮间充质修复,导致气道重塑。线粒体是内源性活性氧最重要的来源,抑制线粒体损伤,进而抑制氧化应激过程,是减轻上皮细胞损伤,抑制气道重塑的有效方法,可能是哮喘治疗新的突破。本课题组既往研究证明了哮喘气道重塑大鼠气道上皮细胞线粒体结构改变,但对线粒体功能损伤及具体调控机制仍不清楚。SP是与哮喘密切相关的感觉神经肽。SP通过与其特异性受体NK-1R结合发挥生物活性,NK-1R主要存在于气管上皮、支气管平滑肌周围、血管平滑肌周围组织、粘膜下腺。研究表明SP与氧化应激密切相关,可以诱导线粒体源性活性氧的释放。Nrf2是具有抗氧化、抗炎作用的转录调节因子,与线粒体功能调控相关,在改善哮喘气道炎症及氧化应激方面均有重要作用。氧化应激可导致Nrf2与Keap1解离,Nrf2与核定位信号结合,快速移位至细胞核,从而被激活。进入细胞核后,Nrf2与ARE结合,启动下游多种保护性基因的转录。其中,HO-1是一种重要的内源性抗氧化剂和细胞保护性酶,参与对线粒体损伤的调控。过敏性哮喘发作时,肺组织HO-1表达增加。Nrf2/HO-1的激活对线粒体损伤有保护作用。我们推测SP可能参与了哮喘气道上皮细胞线粒体结构及功能损伤的发病机制,Nrf2可能参与了其中的调控。为进一步验证这一推测,本研究将分别进行体内、体外实验,应用BALB/c小鼠急性哮喘模型以及IL-13诱导人支气管上皮细胞16HBE,给予NK-1R拮抗剂(WIN 62,577)干预,来探讨NK-1R拮抗剂对哮喘小鼠气道上皮线粒体结构及功能损伤的保护作用,并通过转染Nrf2shRNA沉默Nrf2表达,探讨其调控机制。研究方法:1、建立经典的OVA致敏及激发的BALB/c小鼠急性哮喘模型。雌性BALB/c小鼠32只,随机分为4组,对照组、哮喘组、WIN 62,577(NK-1R拮抗剂)干预组、地塞米松(控制哮喘经典药物)干预组,每组8只。无创肺功能仪检测各组小鼠气道反应性;ELISA检测BALF、血清中SP及IL-13含量;免疫组化观察SP及NK-1R在气道内的表达。BALF中WBC及EOS计数;肺组织病理:HE染色、MASSON染色、PAS染色。2、透射电镜观察线粒体超微结构;线粒体的功能检测:ROS水平(DCFH-DA荧光)、ATP含量、线粒体膜电位水平(JC-1荧光);Western blot检测Nrf2在细胞核/细胞浆的表达水平,肺组织HO-1表达水平。3、体外培养正常人支气管上皮细胞系16HBE,分为正常对照组、IL-13诱导组、IL-13+SP干预组、IL-13+WIN 62,577干预组。MTT检测各组细胞增殖活性;ROS检测(DCFH-DA荧光)、ATP含量检测、线粒体膜电位检测(JC-1荧光);Western blot检测Nrf2在细胞核/细胞浆表达水平、HO-1表达水平。免疫荧光观查Nrf2核内移情况。4、转染Nrf2 shRNA质粒,沉默Nrf2表达,PCR及Western blot方法分别验证质粒转染是否成功。Western blot检测转染后各组细胞Nrf2、HO-1蛋白表达水平。通过ROS检测(DCFH-DA荧光)、ATP含量检测、线粒体膜电位检测(JC-1荧光),来观察转染后线粒体功能变化。结果:1、急性哮喘小鼠模型成功建立;哮喘组小鼠气道反应性增高,NK-1R拮抗剂WIN 62,577能降低哮喘小鼠气道高反应性;哮喘组BALF及血清中SP、IL-13含量显著增加,WIN 62,577干预后SP、IL-13含量显著降低;免疫组化显示哮喘组小鼠气道内SP及NK-1R表达增加,WIN 62,577干预后SP及NK-1R表达减少;哮喘组小鼠BALF中WBC及EOS计数显著增高,WIN 62,577干预后WBC及EOS计数显著减少;HE染色可见,WIN 62,577干预后哮喘小鼠肺组织气道炎症改变明显减轻,Masson染色显示胶原沉积减轻,PAS染色杯状细胞明显减少。2、透射电镜观察哮喘组上皮纤毛断裂、脱落,排列紊乱不规则,杯状细胞增多;上皮细胞内线粒体增多,外膜破损,肿胀密度减低,空泡化,线粒体嵴中断消失,可见自噬小体;上皮下可见胶原沉积,肌层增厚,给予WIN62,577后上述改变见减轻。WIN 62,577干预后,ROS水平降低,ATP浓度升高,线粒体膜电位显著升高。WIN 62,577干预可上调细胞核内Nrf2及肺组织HO-1蛋白表达。3、WIN 62,577可显著抑制IL-13诱导的16HBE细胞增殖活性的下降、ROS释放、ATP下降及线粒体膜电位下降。WIN 62,577上调IL-13诱导的16HBE细胞胞核内Nrf2、细胞HO-1蛋白水平;免疫荧光显示WIN 62,577可增加Nrf2核内移。4、转染Nrf2 shRNA质粒,沉默Nrf2表达后,各组HO-1表达下调。转染后IL-13诱导的16HBE细胞内ROS水平增加、ATP水平下降、线粒体膜电位水平降低。结论:1、NK-1R拮抗剂能降低哮喘小鼠气道炎症及气道高反应性。2、NK-1R拮抗剂能改善哮喘小鼠气道线粒体结构及功能损伤。3、NK-1R拮抗剂能抑制IL-13诱导引起16HBE细胞增殖能力的降低,改善IL-13诱导的16HBE细胞线粒体功能损伤。4、转染Nrf2 shRNA沉默Nrf2表达,降低了NK-1R拮抗剂对IL-13诱导的16HBE细胞线粒体损伤的保护作用。