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第一部分LncRNA AFAP1-AS1在甲状腺癌组织中的表达增加目的 已有报道lncRNA AFAP1-AS1在多种肿瘤的发生发展中发挥重要作用,而AFAP1-AS1在人甲状腺癌组织中的表达及临床病理学意义并不明确。本研究旨在探索AFAP1-AS1在甲状腺癌中的表达情况,并探讨其表达与甲状腺癌临床病理学特征的相关性。方法 采用实时定量PCR(qRT-PCR)方法检测AFAP1-AS1在36对甲状腺癌组织和癌旁正常甲状腺组织中的mRNA的表达情况,收集临床资料,分析AFAP1-AS1表达和临床病理学意义的相关性。结果 与癌旁正常甲状腺组织相比,甲状腺癌组织中AFAP1-AS1 mRNA的表达水平明显增高,并且AFAP1-AS1的高表达与患者的临床分期及颈淋巴结转移呈正相关(p=0.006,p=0.008)。结论 在甲状腺癌组织中AFAP1-AS1表达升高,并且与患者的临床分期及颈淋巴结转移呈正相关。AFAP1-AS1在甲状腺癌中可能作为促癌基因发挥作用。第二部分下调lncRNA AFAP1-AS1抑制甲状腺癌细胞增殖、促进细胞凋亡、抑制细胞侵袭及迁移目的 体外实验检测甲状腺癌细胞株K-1,TPC-1,SW579,FTC133和XTC-1以及正常甲状腺滤泡上皮细胞Nthy-ori3-1中AFAP1-AS1 mRNA的表达:改变甲状腺癌细胞中AFAP1-AS1的表达水平后,检测甲状腺癌细胞增殖、凋亡、侵袭迁移能力的改变,初步探讨AFAP1-AS1在甲状腺癌发生发展过程中的作用。方法 采用qRT-PCR方法检测AFAP1-AS1在甲状腺癌细胞株与正常甲状腺滤泡上皮细胞中的表达;利用AFAP1-AS1的siRNAs敲减甲状腺癌细胞系FTC133和SW579中AFAP1-AS1的表达,通过MTT法、CCK8生长曲线、克隆形成实验检测甲状腺癌细胞的生长增殖能力的变化;流式细胞术、TUNEL实验及Western blot检测甲状腺癌细胞凋亡情况的改变;Transwell小室实验检测甲状腺癌细胞侵袭、迁移能力的变化。结果 甲状腺癌细胞株K-1,TPC-1,SW579,FTC133和XTC-1中AFAP1-AS1的mRNA表达明显高于正常甲状腺滤泡上皮细胞Nthy-ori3-1;在较高表达AFAP1-AS1的FTC133和SW579细胞中敲低AFAP1-AS1后,MTT法、CCK8生长曲线联合克隆形成试验检测显示甲状腺癌细胞增殖能力下降;流式细胞术、TUNEL实验检测细胞凋亡则发现,敲低AFAP1-AS1表达后细胞凋亡增加;并且Western blots技术检测到凋亡相关蛋白(cleaved-caspase3、cleaved-caspase9)表达增加;Transwell 小室检测结果表明下调AFAP1-AS1表达后,甲状腺癌细胞侵袭及迁移能力明显下降。结论AFAP1-AS1在甲状腺癌细胞株中的表达高于正常甲状腺滤泡上皮细胞;甲状腺癌细胞中下调AFAP1-AS1的表达可以抑制肿瘤细胞增殖,促进细胞凋亡,抑制肿瘤细胞侵袭及迁移。第三部分LncRNA AFAP1-AS1调控β-catenin的表达及核浆转移的分子机制研究目的 探讨AFAP1-AS1促进甲状腺癌细胞侵袭迁移的可能机制,明确AFAP1-AS1调控β-catenin的蛋白表达及核浆转移的分子机制,阐明AFAP1-AS1在甲状腺癌细胞上皮-间充质转化(EMT)和侵袭迁移过程中的作用。方法 在甲状腺癌细胞系FTC133和SW579中稳定敲低AFAP1-AS1,采用Western blot检测上皮-间充质转化(EMT)相关指标的变化;同时采用qRT-PCR、Western blot分别检测β-catenin的mRNA及蛋白表达水平;采用蛋白合成抑制剂放线菌酮联合处理细胞,Western blot检测细胞内β-catenin降解水平的变化;在利用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞后,Western blot及免疫共沉淀实验检测β-catenin泛素-蛋白酶体降解水平的变化;采用免疫荧光技术检测甲状腺癌细胞内β-catenin的表达及核浆定位情况。结果 在FTC133和SW579细胞株中敲减AFAP1-AS1后,抑制了甲状腺癌细胞EMT进展,具体表现为上皮性标志物E-cadherin表达上升,且间质性标志物N-cadherin、Vimentin表达下降:同时,β-catenin的mRNA水平变化不明显,而蛋白表达水平明显下降;在利用防线菌酮处理细胞后发现,敲减AFAP1-AS1,β-catenin降解速度增加;联合使用MG132处理细胞,Western blot及免疫共沉淀实验检测到β-catenin是通过泛素-蛋白酶体途径降解的:最后,免疫荧光技术检测到甲状腺癌细胞敲减AFAP1-AS1后,β-catenin由细胞核向细胞浆转移。结论 下调AFAP1-AS1抑制甲状腺癌细胞EMT进展,AFAP1-AS表达变化不影响β-catenin的mRNA水平,但是影响β-catenin的蛋白表达。下调AFAP1-AS导致β-catenin蛋白表达下降,促进β-catenin蛋白通过泛素-蛋白酶体途径降解,并且改变β-catenin在细胞内的定位。总之,AFAP1-AS可能通过调控β-catenin的蛋白表达及细胞定位来调控EMT,从而影响甲状腺癌细胞侵袭迁移。