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背景大肠癌是常见的消化道恶性肿瘤,死亡率高居恶性肿瘤相关死亡的第2位。大肠癌的侵袭转移是导致临床治疗失败和患者死亡的主要原因。大肠癌的发生发展是一个多环节、多步骤的复杂过程。尽管Wnt信号通路的异常激活被认为是大肠癌发生的始动因素,但是在绝大多数大肠癌中高表达的环氧合酶-2（cyclooxygenase-2, COX-2）被认为在肿瘤进展和侵袭转移过程中起着关键作用。过表达的COX-2可产生大量的前列腺素E2（Prostaglandin E2, PGE2）,共同参与细胞恶性转化、抑制细胞凋亡、促进肿瘤血管新生、抑制抗肿瘤免疫等机制调控多种肿瘤发生、血管生成、侵袭转移等。因此,COX-2可能是抗肿瘤作用的一个靶点。目前,临床常用的COX-2抑制剂主要是非甾体类抗炎药（nonsteroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs）,包括非选择性COX抑制剂和选择性COX-2抑制剂（COXIBs）。流行病学和临床研究已经证实,NSAIDs可有效预防胃肠道肿瘤。然而,长期应用非选择性NSAIDs可引起腹痛、消化性溃疡、消化道出血甚至穿孔；选择性COX-2抑制剂虽然消化道的副作用减轻,但其心血管毒性亦不可忽视,限制了其在肿瘤防治中的作用。目前塞来昔布（商品名西乐葆）是美国FDA唯一批准的大肠癌化学预防剂,但也仅推荐用于家族腺瘤息肉病的高风险患者,不推荐常规用于临床。因此,更为安全有效的COX-2的抑制剂有待进一步发现和研究。丹皮酚（Paeonol）,又称牡丹酚,是从中草药牡丹、芍药根皮和徐长卿干燥根或全草中提取的单体成分。研究表明,丹皮酚具有广泛的药理学活性,包括抗炎、肝肾保护、降血糖、免疫调节、心血管保护、抗菌、解热镇痛、抗过敏、抑制血小板聚集和中枢抑制作用等。近年来,大量的研究发现,丹皮酚在体内外对多种肿瘤细胞均有抗肿瘤作用。但是,丹皮酚对于肿瘤中特别是大肠癌中COX-2的作用及其意义并未报道,因此,本研究以COX-2及其产物PGE2为切入点,对丹皮酚在大肠癌中特别是侵袭转移中的作用及其作用机制进行探讨。实验一丹皮酚通过下调COX-2表达及PGE2合成抑制大肠癌细胞增殖及诱导细胞凋亡目的：观察丹皮酚对大肠癌细胞增殖活性和细胞凋亡的影响,并探讨丹皮酚对大肠癌的抑制作用是否与其下调COX-2表达及PGE2合成有关。方法：以大肠癌LoVo、HCT116、SW620细胞株为研究对象,MTT法检测不同浓度丹皮酚处理三种细胞株后细胞存活率；选取丹皮酚作用效果最明显的细胞株,MTT法检测PGE2对细胞增殖的影响及丹皮酚对PGE2刺激细胞增殖的影响；丹皮酚处理大肠癌细胞48 h后,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡；Western blot方法检测COX-2和凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9的表达情况；ELISA法检测大肠癌细胞上清液中PGE2含量；激光共聚焦显微镜检测细胞内Ca2+浓度；Rho123染色流式细胞仪检测线粒体膜电位水平。并采用MTT法及流式细胞术检测COX-2特异性抑制剂塞来昔布对大肠癌细胞增殖和凋亡的影响；应用COX-2 siRNA转染大肠癌细胞,RT-PCR及Western blot方法检测COX-2mRNA和蛋白水平的变化,并采用MTT法及流式细胞术检测转染前后对细胞增殖和凋亡的影响。结果：丹皮酚对LoVo、HCT116、SW620三组大肠癌细胞株均有抑制作用,且对LoVo细胞的抑制作用最为明显,呈明显的时间和剂量依赖性；丹皮酚可阻滞LoVo细胞周期,导致S期细胞比例降低；流式细胞仪检测结果显示丹皮酚可诱导LoVo细胞凋亡；丹皮酚可降低LoVo细胞COX-2表达及上清液中PGE2含量；PGE2处理后LoVo细胞活力明显增强,丹皮酚可抑制PGE2诱导的LoVo细胞活力的增加；塞来昔布处理或COX-2 siRNA转染后,LoVo细胞活力显著降低,且细胞凋亡率增加；此外,丹皮酚处理后,LoVo细胞内Ca2+含量升高；Bax蛋白表达上调,而下调Bcl-2蛋白的表达,Pro-Caspase-3、Pro-Caspase-9表达减弱,而Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9表达增强,呈浓度依赖性；细胞线粒体膜电位下降。结论：丹皮酚可抑制LoVo细胞增殖并诱导细胞凋亡,可能的机制是通过下调COX-2表达及PGE2合成进而阻滞LoVo细胞周期、激活线粒体凋亡途径。实验二丹皮酚通过下调COX-2表达及PGE2合成抑制大肠癌上皮间质转化降低细胞侵袭能力目的：观察丹皮酚对LoVo细胞侵袭能力的影响,并探讨丹皮酚降低LoVo细胞侵袭能力是否与其下调COX-2表达及PGE2合成有关。方法：不同浓度丹皮酚处理LoVo细胞24 h后,采用Transwell进行细胞侵袭试验；划痕试验进行细胞迁移试验；免疫荧光检测细胞膜E-cadherin蛋白表达；Western blot方法检测COX-2、MMP-9、NF-κB通路蛋白、EMT标志物、ERK/MAPK通路蛋白和PI3K/Akt通路蛋白表达；Transwell法检测PMA对LoVo细胞侵袭能力的影响及丹皮酚对PMA诱导LoVo细胞侵袭能力增加的影响,Western blot方法检PMA对LoVo细胞COX-2表达及丹皮酚对PMA诱导LoVo细胞COX-2表达增加的影响；Transwell法检测塞来昔布、COX-2 siRNA转染及NF-κB通路阻滞剂PDTC对LoVo细胞侵袭能力的影响；Western blot方法检测塞来昔布对E-cadherin表达的影响；Western blot方法检测COX-2 siRNA转染对LoVo细胞MMP-9、E-cadherin、ERK/MAPK通路蛋白和PI3K/Akt通路蛋白表达的影响。结果：丹皮酚可抑制LoVo细胞侵袭和迁移,并降低COX-2、MMP-9表达和PGE2合成,且可抑制PMA诱导的细胞侵袭能力的增加；丹皮酚可上调E-cadherin表达并下调Vimentin、Fibronectin表达；丹皮酚处理后,LoVo细胞核内NF-KB/p65表达降低,胞浆IκBa表达升高,同时胞浆IKKa表达降低；细胞总的ERK水平无明显改变,而ERK磷酸化水平降低；细胞总的Akt表达量没有变化,而p-Akt表达减少,同时,Akt下游效应蛋白p-GSK-3β表达也减少。塞来昔布、COX-2 siRNA转染及NF-κB通路阻滞剂PDTC均可降低LoVo细胞侵袭能力；COX-2 siRNA转染后可上调E-cadherin表达,并下调p-ERK、p-Akt及p-GSK-3β表达。结论：丹皮酚可降低LoVo细胞侵袭能力,其机制可能是通过降低COX-2表达及PGE2合成阻滞ERK/MAPK通路蛋白和PIK/Akt通路,进而抑制EMT,最终降低细胞侵袭能力。