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研究背景结直肠癌为常见多发的恶性肿瘤,据报告全美国2012年结直肠癌新发病例数及死亡病例数均居全部恶性肿瘤的第3位。尽管我国结直肠癌基础研究与早期干预有较大进步,但其发病率与死亡率仍呈明显上升趋势,日益成为严重危害人类健康的重要疾病。已有研究证明结直肠癌等恶性肿瘤中存在肿瘤干细胞(Cancer Stem Cell; CSC), CSC是一群具有很强的自我更新能力和多向分化潜能的细胞,虽在肿瘤细胞中所占比例很小,但在肿瘤发生,治疗抵抗,复发转移中起着重要的作用。因此治疗结直肠癌关键在于清除结直肠癌干细胞(Colorectal Cancer Stem Cell, CCSC)。小分子化合物阿司匹林(Aspirin)是世界上使用最多,使用时间最长,且不会产生药物依赖性的非甾体抗炎药。流行病学和临床实验表明,Aspirin除了用于解热、抗血小板凝聚等,还可防治包括结直肠癌、食道癌、肺癌在内的多种肿瘤。大量证据也表明阿司匹林能够明显降低结直肠癌发生率和死亡率、改善患者预后,但其作用机制不明。最近有文献报道非甾体抗炎药(吲哚美辛)能够降低结直肠癌细胞系中CCSC的数量。但是,Aspirin是否能抑制CCSC及其具体的分子调控机制尚未见报道。因此,深入研究Aspirin对CCSC效应有助于拓展Aspirin的临床应用,可为筛选结直肠癌治疗的潜在分子靶点、设计更加高效抗肿瘤药物提供理论基础,具有重要的临床意义,是当前迫切需要探索和解决的重要科学前沿问题。研究方法利用无血清培养体系从原代结直肠癌细胞及ATCC标准细胞系中富集CCSC,并对其生物学特性(克隆球形成能力,耐药性,成瘤性,肿瘤干细胞比例,干性基因表达水平)等进行鉴定。在培养体系中加入不同浓度梯度的Aspirin,比较处理前后CCSC生物学特性的改变。利用MTS实验检测Aspirin对CCSC的杀伤效应是否具有选择性,并免疫荧光和流式细胞术分析其通过何种方式(凋亡/自噬)选择性抑制CCSC.还利用定量PCR检测CCSC和1on-CCSC中凋亡相关基因表达水平,筛选Aspirin通过何种凋亡因子诱导细胞凋亡,进一步采用封闭性抗体抑制相关通路后检测Aspirin对CCSC的影响。同时还应用染色质免疫沉淀技术从表观遗传学角度探讨了该凋亡因子的上游调控机制。研究结果1.利用无血清培养技术富集的CCSC具有典型的肿瘤干细胞特性,Aspirin能抑制CCSC的肿瘤干细胞特性。利用无血清培养体系从原代结直肠癌细胞及ATCC标准细胞系HT29中成功富集了CCSC,与non-CCSC比较,CCSC克隆球形成能力明显加强,干性基因(Sox2, Oct4, Nanog, Notchl, Bmi-1和ALDHl)的表达水平明显升高,干细胞标记ALDH1的表达水平明显增高,对化疗药物奥沙利铂(OXA)的耐药性明显增加,体内成瘤性也明显增强。CCSC中加入不同浓度梯度的Aspirin (0,2.5,5.0,10.0mM),与对照组比较,Aspirin能抑制克隆球的数量和减少其直径,降低干性基因(Sox2, Oct4, Nanog, Notchl, Bmi-1和ALDH1)的表达水平以及干细胞标记ALDH1的表达水平,增加CCSC对OXA的敏感性,且这些效应呈明显的剂量依赖性。体内成瘤实验也表明Aspirin能抑制CCSC的生长,降低其成瘤体积。这些结果证实在Aspirin能明显地抑制CCSC干细胞特性。2. Aspirin通过上调FasL选择性诱导CCSC凋亡。既然Aspirin能明显地抑制CCSC,那么Aspirin对CCSC和non-CCSC的抑制作用是否存在着差异?我们的研究证实Aspirin选择性抑制了CCSC.目前的研究报道Aspirin主要是通过诱导凋亡或自噬抑制肿瘤细胞,我们的结果发现Aspirin选择性地诱导了CCSC的凋亡而不是自噬。凋亡分为外源性凋亡途径和内源性凋亡途径,我们的研究证实Aspirin上调CCSC中的FasL,通过外源性的凋亡途径介导其凋亡。而在non-CCSC中FasL,Fas均出现下调,因此选择性地诱导了CCSC的凋亡。并且利用封闭性抗体封闭FasL后,CCSC的存活率明显增加,凋亡细胞明显减少。3. Aspirin通过非COX-2途径上调FasL。Aspirin抗结直肠癌的经典机制是认为Aspirin降低了COX-2的酶活性进而影响了PGE2的合成,我们的研究证实加入Aspirin后CCSC中的COX-2的酶活性出现了降低,但是通过特异性的siRNA抑制COX-2,或者小分子抑制剂NS-398并不能诱导CCSC的凋亡,也不能上调FasL的表达。另一方面,在CCSC中同时加入Aspirin和PGE2并不能降低凋亡的比率及下调FasL的表达,这些证据提示Aspirin通过非COX-2途径上调FasL。4. Aspirin通过乙酰化组蛋白H3来上调FasL。我们比较了非甾体抗炎药包括(水杨酸,Aspirin,吲哚美辛,布诺芬,舒林酸)对CCSC中FasL的影响,发现仅Aspirin能上调FasL的表达。而比较这些非甾体抗炎药结构,我们发现Aspirin中具有乙酰基团,提示乙酰化在上调FasL中起着重要的作用。去乙酰化酶抑制剂TSA处理CCSC后FasL水平明显上调。分析组蛋白乙酰化程度后发现仅组蛋白H3乙酰化程度升高,且升高的乙酰化组蛋白H3促进了FasL的转录。研究结论Aspirin能显著抑制CCSC的肿瘤干细胞特性,同时通过选择性上调FasL诱导其凋亡来抑制CCSC。Aspirin上调FasL是非COX-2依赖的,通过乙酰化组蛋白H3来调控FasL的转录。该研究不仅拓展Aspirin的临床应用,更为以后筛选结直肠癌治疗的潜在分子靶点、设计更加高效抗肿瘤药物提供理论基础。