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氟是普遍存在于自然界中的一种人和动物所必需的微量元素,也是一种常见的工业与环境污染物。适当浓度的氟有益于人和动物牙齿、骨骼的正常发育,但当机体摄入的氟过量时,会造成急性或慢性氟中毒,导致氟斑牙、氟骨症、呼吸系统、泌尿生殖系统、消化系统、神经系统、抗氧化系统和免疫系统的损伤。牙釉质发育过程中,机体摄入过量的氟会诱发氟斑牙,牙釉质钙化不足、斑驳、变色、多孔易腐烂。成釉细胞通过分泌釉质基质蛋白,管理基质矿化促进牙釉质的发育。研究显示氟能通过诱导成釉细胞氧化损伤和凋亡导致氟斑牙的形成。尽管氟斑牙的研究已有几十年的历史,但针对氟诱导氟斑牙形成的分子机制研究仍不多见。p53是肿瘤抑制蛋白,乙酰化的p53参与细胞周期和凋亡的调控。因此,本研究以小鼠成釉细胞系（LS8细胞）为研究对象,采用Elisa、DAPI染色、MTT、实时荧光定量PCR（q RT-PCR）、蛋白印迹、免疫细胞化学染色法、免疫共沉淀等实验方法,探讨p53乙酰化信号通路在氟化钠（NaF）诱导成釉细胞凋亡中的作用机制,为治疗和预防氟斑牙提供新的理论依据。试验一:p53乙酰化在NaF诱导成釉细胞凋亡中的作用试验选用LS8细胞分别在加入和不加入NaF（5mM）的培养基中培养0.5 h、1 h、2 h、4 h、6 h、18 h和24 h。Elisa法和DAPI染色结果显示NaF诱导了细胞凋亡;结晶紫染色发现,NaF减少了LS8细胞密度,改变了LS8细胞形态。q RT-PCR结果显示,Bax mRNA表达水平在18 h和24 h显著升高。NaF处理的第6 h、18 h和24 h,Bcl-2 mRNA表达水平显著下降,而Bax/Bcl-2 mRNA表达的比值显著升高。蛋白印迹结果发现从NaF处理细胞的第2 h起,Acetyl-p53蛋白表达水平上调,表明p53乙酰化水平升高;γH2AX、cleaved-caspase 9、细胞质中Cyt c蛋白表达水平在6 h、18 h、24 h显著升高,Bax、cleaved-caspase 3蛋白表达水平在处理的第18 h和24 h显著升高,Bcl-2、线粒体中Cyt c蛋白表达水平从6 h开始显著降低,Bax/Bcl-2蛋白表达水平比值从第6 h开始显著升高。结果表明NaF通过p53乙酰化诱导了成釉细胞凋亡,诱导途径为线粒体凋亡途径。试验二:p53/MDM2/p21信号通路在NaF诱导成釉细胞凋亡中的作用试验选用LS8细胞分别在加入和不加入NaF（5mM）的培养基中培养0.5 h、1 h、2 h、4 h、6 h、18 h和24 h。结果显示NaF处理细胞6 h后MDM2和p21 mRNA表达水平显著升高,同时细胞内MDM2和p21的磷酸化蛋白表达水平也显著升高,p21蛋白表达水平在NaF处理细胞的0.5-2 h显著升高,但在18 h和24 h显著下降。结果说明NaF上调了p53下游靶蛋白MDM2、p21 mRNA和p-MDM2、p-p21的蛋白表达水平。试验选用LS8细胞,用MDM2拮抗剂Nutlin-3a或蛋白酶体抑制剂MG-132预处理细胞2 h,再分别加入5mM NaF处理6 h或24 h。结果发现,处理的第6 h,NaF促进了MDM2与p53和p21的相互作用,而Nutlin-3a抑制了MDM2与p53和p21的相互作用。处理的第24 h,Nutlin-3a抑制了细胞凋亡,增加了p53、MDM2、p21和p-p21的蛋白表达水平和MDM2 mRNA表达水平,抑制了Cyt c从线粒体释放至胞质,降低了Bax/Bcl-2蛋白表达水平的比值,也下调了cleaved-caspase 9、cleaved-caspase 3和γH2AX蛋白质表达水平。MG-132抑制了细胞凋亡和p21、p-p21蛋白降解,降低了Bax/Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平的比值,增加了线粒体Cyt c蛋白表达水平,抑制Cyt c从线粒体释放至胞质,下调了cleaved-caspase 9、cleaved-caspase 3和γH2AX蛋白表达水平。以上结果表明,Nutlin-3a和MG-132可抑制NaF诱导的成釉细胞凋亡,p53/MDM2/p21信号通路是促进NaF诱导成釉细胞凋亡的分子途径。试验三:组蛋白乙酰转移酶在NaF诱导成釉细胞凋亡中的作用试验选用LS8细胞分别在加入和不加入NaF（5mM）的培养基中培养0.5 h、1 h、2 h、4 h、6 h、18 h和24 h。结果显示组蛋白乙酰转移酶CBP mRNA表达水平在NaF处理后6 h和18 h显著升高,P300 mRNA表达水平在24 h显著降低,Tip60 mRNA表达水平在6 h显著升高。Acetyl-CBP/P300蛋白表达水平在NaF处理细胞后1 h至18 h显著上升。p-Tip60蛋白表达水平从处理的第2 h开始显著升高。同时,在处理的第2 h,NaF增强了CBP与p53的相互作用。结果表明氟化钠增强了组蛋白乙酰转移酶（CBP、P300和Tip60）的活性,促进了组蛋白乙酰转移酶与p53的相互作用。用组蛋白乙酰转移酶抑制剂处理LS8细胞:姜黄素（curcumin）或MG-149（Tip60特异性抑制剂）和5mM NaF处理细胞6 h、18 h和24 h。结果表明,在处理的18 h和24 h,与NaF组比较curcumin和MG-149增强了细胞增殖能力,抑制了细胞凋亡。处理的第6 h和18 h,curcumin抑制了NaF诱导的CBP/P300的乙酰化。处理的第6 h、18 h和24 h,curcumin和MG-149也抑制NaF诱导的Tip60磷酸化和p53乙酰化。处理的第18 h和24 h,curcumin和MG-149降低了胞质Cyt c、cleaved-caspase 9、cleaved-caspase 3、γH2AX蛋白表达水平和Bax/Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平的比值。以上结果表明,抑制组蛋白乙酰转移酶活性能减弱NaF通过p53乙酰化诱导的细胞凋亡,继而说明NaF可通过增强组蛋白乙酰转移酶活性调控p53乙酰化促进成釉细胞凋亡。试验四:SIRT1-p53信号通路在NaF诱导成釉细胞凋亡中的作用试验选用LS8细胞分别在加入和不加入NaF（5mM）的培养基中培养0.5 h、1 h、2 h、4 h、6 h、18 h和24 h。结果显示,NaF增加了SIRT1 mRNA表达水平和p-SIRT1蛋白表达水平,表明NaF增强了SIRT1的去乙酰化活性。试验选用LS8细胞(LS8WT),SIRT1过表达LS8细胞(LS8SIRT1/Over)以及对照细胞(LS8Lac Z),用NaF处理细胞6 h。免疫共沉淀试验发现NaF减弱了LS8细胞(LS8WT)和LS8Lac Z细胞内SIRT1与Tip60和p53的相互作用,但并未改变LS8SIRT1/Over细胞内SIRT1与Tip60和p53的相互作用。结果表明SIRT1过表达增强了SIRT1与Tip60和p53的相互作用。试验选用LS8细胞(LS8WT),SIRT1过表达LS8细胞(LS8 SIRT1/Over)以及对照细胞(LS8Lac Z),用NaF分别处理细胞6 h、18 h和24 h。结果显示,与LS8WT或LS8Lac Z细胞比较,第18 h和24 h,LS8 SIRT1/Over细胞凋亡率显著降低;第6 h、18 h和24 h,Tip60 mRNA表达水平,p-Tip60、Tip60和Acetyl-p53蛋白表达水平在LS8SIRT1/Over细胞中显著降低,第18 h和24 h,Bax/Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平的比值、cleaved-caspase 9、cleaved-caspase 3和γH2AX蛋白水平也显著下降。在LS8WT或LS8Lac Z细胞中,NaF处理细胞18 h和24 h后,诱导Cyt c向胞质释放,而在LS8SIRT1/Over细胞中Cyt c的释放受到抑制。结果表明,SIRT1过表达抑制NaF诱导的p53乙酰化,从而抑制成釉细胞凋亡。上述结果表明,NaF增强了组蛋白乙酰转移酶的活性,诱导p53乙酰化,通过线粒体凋亡途径促进成釉细胞凋亡。p53乙酰化诱导MDM2和p21mRNA表达,MDM2磷酸化促进MDM2-p21结合,诱导p21降解,导致LS8细胞凋亡。SIRT1通过负调控Tip60,抑制Tip60磷酸化,或直接与p53相互作用,去乙酰化p53,缓解NaF诱导的细胞凋亡。p53乙酰化在NaF诱导成釉细胞凋亡中起重要作用。乙酰化的p53可能是氟斑牙潜在的治疗靶点。本研究证实了NaF通过p53乙酰化诱导成釉细胞凋亡,明确了NaF诱导成釉细胞凋亡与p53/MDM2/p21信号通路的关系,深入探讨了组蛋白乙酰转移酶和SIRT1在NaF诱导p53乙酰化促进成釉细胞凋亡中的作用。