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纤维素是自然界中分布最广、含量最丰富的一种多糖。能源危机、环境污染和粮食短缺，使得越来越多的国家开始选择使用纤维素为原料来生产乙醇。水解纤维素的酶系包括内切酶（EG）、外切酶（CBH）和β-葡萄糖苷酶（BGL），它们三个的共同作用可以将纤维素水解为单糖，而后能被酿酒酵母发酵产醇。本课题采用δ-整合的方法在酿酒酵母中表达这三种纤维素酶，从而构建能利用纤维素产醇的酿酒酵母工程菌株。本实验室已构建了棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus）β-葡萄糖苷酶bgl1基因表达盒Ptpi-xyn2s-ABGL1-Tadh I和瑞氏木霉（Trichoderma reesei）内切酶egl2基因表达盒Ptpi-xyn2s-TEGII-Tadh I。因此本研究首先分离、克隆了全长的棘孢曲霉外切酶基因cbh1，测序后经比对首次鉴定出其有1个内含子，2个外显子，以此为基础，成功构建了棘孢曲霉外切酶基因表达盒Ptpi-xyn2s-ACBHI-Tadh I。同时还构建了瑞氏木霉外切酶基因cbh1基因表达盒Ptpi-xyn2s-TCBHI-Tadh I和瑞氏木霉外切酶基因cbh2基因表达盒Ptpi-xyn2s-TCBHII-Tadh I。为将以上基因表达盒高拷贝整合至酿酒酵母染色体，本文构建了含LEU2、HIS3、TRP1和URA34种不同筛选标记的δ-整合平台，以棘孢曲霉bgl1和瑞氏木霉egl2为目的基因，评价了δ-整合平台中不同筛选标记对外源基因表达的影响。第5天的BGL和EG酶活（U/ml）结果表明：筛选标记影响纤维素酶基因的表达，LEU2使外源基因表达最高（2.97/29.01），其次是HIS3（2.29/12.41）和TRP1（1.78/8.12），而URA3最低（1.52/1.48）；各菌株5天内的比酶活（U/ml/OD660）基本为一定值，分别在0.193~0.207/1.9~2.1、0.087~0.093/0.87~0.95、0.067~0.073/0.5~0.54和0.028~0.032/0.09~0.11范围内。将5个δ-整合质粒（pGEM-T easy-δseq-TRP1-TEGII、pGEM-T easy-δseq-HIS3-ABGL1、pGEM-T easy-δseq-LEU2-ACBHI、pGEM-T easy-δseq-LEU2-TCBHI和pGEM-T easy-δseq-LEU2-TCBHII）分三轮转入酿酒酵母染色体中，筛选重组子，并进行PCR鉴定、酶活分析以及纤维素发酵评价等，结果表明：纤维素内切酶、外切酶和β-葡萄糖苷酶基因均已导入酿酒酵母染色体中，使得酵母可以直接利用纤维素发酵产醇；当添加3.3U/g料的和氏璧纤维素酶时，发酵5天重组菌株产醇最高可达17.82g/l，而对照菌株W303-1A和工业菌株安琪酵母产醇浓度分别仅有1.23g/l和2.12g/l。