论文部分内容阅读
本文采用无水甲醇为提取溶剂从柿子果肉中提取单宁，通过考察提取剂种类、提取温度、时间、提取次数及料液比等因素来确定了柿子单宁的最佳提取工艺；采用大孔树脂101结合超滤分离实现了柿子单宁的分离纯化及分级制备，得到了高分子量单宁（HMWT）和小分子量单宁（SMWT）两个级分。采用高效液相-电喷雾质谱联用（HPLC-ESI-MS）对小分子结构进行了初步鉴定；采用凝胶渗透色谱（GPC）、傅立叶红外光谱（FT-IR）以及硫解和酸解结合HPLC-ESI-MS等方法分析了HMWT分子量分布以及单体结构；并对HMWT与SMWT在不同体系中的的抗氧化活性及HMWT与牛血清白蛋白（BSA）的相互作用进行了系统研究；同时重点研究了HMWT在体外对江浙蝮蛇毒（AhPVP）、尖吻蝮蛇毒（AaVP）、眼镜蛇毒（NnaVP）中蛋白酶活的抑制能力及体内对AhPVP、AaVP、NnaVP染毒小鼠的解毒效果；并结合SDS-PAGE凝胶电泳、红外光谱（FT-IR）、圆二色谱（CD）初步研究了HMWT与蛇毒蛋白的相互作用机理。主要研究结果如下：1．柿子单宁的最佳提取工艺为：新鲜果肉去皮打浆后，以含1％HCL的无水甲醇作为提取介质，料液比1∶12，90℃加热回流提取，提取3次，每次40min。2．提取液经大孔树脂101除糖去杂，聚砜超滤膜分级得到红色的HMWT粉末以及淡黄色SMWT粉末，HMWT缩合单宁（CT）含量93.4％，SMWT总酚（TP）含量为87.4％。两者具有典型的酚类物质显色特征，易溶于水，乙醇，甲醇等溶剂，其中HMWT在水中的最大溶解度为100mg／mL。3．经HPLC-ESI-MS鉴定SMWT主要为没食子酸及分子量分别为461，461，603的三个未知化合物。HMWT分子量分布在1.16×104u-1.54×104u之间，重均分子量1.39×104u，数均分子量1.28×104u，FT-IR表明HMWT具有原花青素的基本骨架结构，硫解和酸解的HPLC-ESI-MS表明其主要组成单体为：表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG），表儿茶素没食子酸酯（ECG），（表）没食子儿茶素（E）GC及一种未知结构的单体。4．HMWT在2-脱氧-D-核糖体系，甲基紫体系，水杨酸体系中对羟基自由基的最大抑制率分别为90.47％、96.46％和87.77％；对邻苯三酚自氧化以及亚油酸脂质过氧化的最大抑制能力分别为56.57％和69.63％。在所有的体系中HMWT的抗氧化能力与加入量呈明显的剂量效应关系，且HMWT的抗氧化能力要优于相同浓度下的葡萄籽原花青素，大大强于SMWT，是柿子单宁抗氧化作用的主导成分。5．HMWT与明胶和BSA均具有较强的结合能力，明胶、BSA与HMWT质量比达到1.6∶1时单宁沉淀率达到最大。HMWT与BSA结合的适宜条件为：温度40℃，反应时间30min，体系pH5.0，0.5mol／L的NaH2PO4为溶解介质。荧光光谱和紫外吸收光谱法分析表明，HMWT可以有规律地使BSA内源荧光猝灭，其猝灭机理可认为是HMWT与BSA形成复合物的静态猝灭、HMWT与BSA的作用力为疏水作用力和静电作用力，同时由F（?）rster非辐射能量转移理论计算得出HMWT与BSA结合位置的距离为1.63nm，结合位点0.99。6．HMWT溶液在光照、温度大于60℃、pH大于7条件下稳定性较差；具有较好的抗氧化性和抗还原性；食品添加剂中β-环状糊精有利于增加HMWT的热稳定性、淀粉在溶液中含量超过O.5％时易与HMWT发生复合作用，柠檬酸三钠对稳定性有较大的影响，柠檬酸、EDTA则影响较小；金属离子中Fe3+，AL3+，Zn2+对HMWT有着较强的结合作用，Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cu2+则影响较小。7．当蛇毒蛋白与HMWT质量比为1∶1时，HMWT对AhPVP、AaVP、NnaVP中蛋白质水解酶、磷脂酶A2、L-氨基酸氧化酶、精氨酸酯酶、乙酰胆碱酯酶、类凝血酶的酶活均基本完全抑制，且呈明显的剂量效应关系。8．HMWT对昆明小鼠腹腔注射的LD50值为301.84mg／kg，具有良好的安全性。当蛇毒蛋白与HMWT质量比为1∶1时，HMWT对AhPVP，AaVP，NnaVP引起的肌肉毒性有极显著（p＜0.01）的抑制作用，肌酸激酶（CK）的酶活抑制率分别为63.30％，55.06％，61.82％，肌肉组织病理学观察也显示出明显的剂量效应关系，高剂量组小鼠肌纤维损伤明显好转。当蛇毒蛋白与HMWT质量比为1∶1时，HMWT能够极显著（p＜0.01）降低AhPVP，AaVP引起的皮下出血，出血抑制率分别为98.6％，96.9％，HMWT对出血的抑制呈明显的剂量效应关系。9．5LD50剂量的AhPVP、AaVP、NnaVP注射入昆明小鼠腹腔后，口服灌胃HMWT后可使AhPVP、AaVP和NnaVp所致的染毒死亡小鼠平均存活时间分别延长4-6倍、3-5倍和2-4倍，高剂量的HMWT可使AhPVP、AaVP和NnaVp所致的染毒小鼠存活率分别提高到75％、50％和25％。腹腔注射HMWT后可使AhPVP、AaVP和NnaVp所致的染毒死亡小鼠平均存活时间分别延长15-30倍、15-20倍和5-15倍，高剂量组对各种蛇毒的解毒作用强，小鼠存活率达100％。静脉注射HMWT对小鼠的急救效果最佳，HMWT中剂量组即可使各组小鼠存活率达100％，低剂量组也能大大延长存活时间并且存活率分别达到了50％、75％、50％。三种解救方式对蛇毒引起的毒害均有急救效果，口服灌胃虽然存活率不高但能有效的延长存活时间，而腹腔注射和静脉注射则能有效提高存活率。口服预防给药HMWT可使AhPVP、AaVP和NnaVp所致的染毒死亡小鼠平均存活时间分别延长3-5倍、3-5倍和1-3倍，说明服用HMWT对蛇毒引起的毒害有一定的预防作用。10．SDS-PAGE结果表明HMWT与蛇毒蛋白结合形成沉淀是导致酶失活的重要原因，虽然HMWT对蛇毒中蛋白质组分的结合表现出一定的非特异性，但对不同组分结合能力和选择性明显不同，且为非可逆结合。AhPVP经Sephadex G-75两次纯化及DEAE Sephadex A-50离子交换层析得到分子量14000的电泳纯磷脂酶A2。红外及圆二色谱结合表明，HMWT中的酚羟基与PLA2中的氨基的相互作用在结合过程中起着重要的作用，且HMWT对PLA2的a-螺旋结构有强烈的破坏作用。