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研究目的有机磷化合物(organophosphorus compounds,OPs)是指含有有机基团的磷酸衍生物,在农药、阻燃剂、增塑剂以及战争毒剂等方面应用比较广泛。除可引起接触者发生急性毒性中毒外,部分有机磷化合物还能导致人类和一些敏感动物发生一种不可逆的迟发性神经病(organophosphate-induced delayed neuropathy, OPIDN),其发病机制目前尚不清楚。自噬是细胞维持自身稳态的重要机制,近年研究发现自噬与多种神经退行性疾病有关,而OPIDN的病理改变也属于神经退行性病变,因此我们推测OPIDN的发生可能也与神经元自噬异常有关。本研究我们通过建立两个动物模型：三邻甲苯磷酸酯(Tri-ortho-cresyl phosphate, TOCP)诱导的OPIDN动物模型以及OPIDN干预动物模型,通过Western-blot实验方法检测母鸡神经组织中自噬相关蛋白及其磷酸化水平的变化,探讨自噬在OPIDN发生中的作用,研究OPIDN发生的分子机制。研究方法1、TOCP诱导OPIDN动物模型和OPIDN干预动物模型的建立选取成年罗曼母鸡60只,适应性饲养3天,其中30只动物用于OPIDN动物模型的建立,即将动物随机分成5组,分别为对照组、1d、5d、10d、21d组,每组6只,将TOCP充分溶解于玉米油中,一次性灌胃进行TOCP染毒,染毒剂量为750mg/kg,同时给予对照组等体积的玉米油,在TOCP染毒后上述相应时间点断头处死动物,在冰袋上快速取出脊髓和胫神经置于液氮中,-80℃保存备用。将另外30只动物用于OPIDN干预动物模型的建立,将动物随机分为6组,分别为对照组、0d、Id、5d、10d、21d组,每组5只,提前24h皮下注射90mg/kg的PMSF后,再染毒剂量为750mg/kg的TOCP,同时也给予对照组等体积的玉米油,在TOCP染毒后上述相应时间点断头处死动物,在冰袋上快速取出脊髓和胫神经置于液氮中,-80℃保存备用。在模型制备过程中,每天观察记录动物的OPIDN症状,并按8级评分标准评价母鸡OPIDN的进展。2、脊髓和胫神经组织中自噬相关蛋白含量的测定取适量脊髓和胫神经组织(脊髓切成小段,胫神经在液氮中碾成粉末),分别按照质量体积比为1：5的比例加入预冷的匀浆缓冲液,在冰水浴中进行匀浆,然后在冰上静置30min,14000r/min、4℃离心30min,取上清、弃沉淀,利用BCATM protein Assay Kit对上清中的总蛋白含量进行定量。Western-blot分别检测脊髓和胫神经组织中自噬相关蛋白Beclin1、p-Beclin1(T119)、ULK1、p-ULK1 (Ser556)、P62、p-P62(Thr/Ser272)含量的变化。研究结果1.实验动物一般状况变化：OPIDN动物模型即TOCP染毒组动物状况变化：前期未观察到动物有任何变化,到第5天时,动物才开始出现轻微的异常变化。随着时间的推移,动物的OPIDN症状进展迅速,由偶尔的站立、行走困难逐渐发展到频发的站立、行走困难,走路出现步态摇摆,经常跌跤。到第15天时,动物几乎不能站立行走,趴到在地,所有动物完全瘫痪,OPIDN症状评分达到8级,这种现象一直持续到整个实验周期结束。对照组在整个实验周期内未见任何异常。OPIDN干预动物模型即PMSF干预组中动物状况的变化PMSF干预组动物与对照组动物在整个实验周期内均未见任何异常状况。2. PMSF干预组神经组织自噬相关蛋白P62、ULK1的变化：提前皮下注射PMSF再染毒TOCP后,脊髓组织中P62与ULK1的蛋白表达量与对照组相比在整个实验周期内未见明显改变,差异无统计学意义；胫神经组织中¨P62与ULK1的表达水平仅在0天的增多具有统计学意义,其他时间点的变化与对照组相比无统计学意义。3.TOCP染毒组神经组织自噬相关蛋白p-P62(Thr/Ser272),p-ULK1(Ser556)、 p-Beclin1(Thr119)的变化：TOCP染毒影响了p-P62(Thr/Ser272)、p-ULK1(Ser556)、 p-Beclinl(Thr119)在神经组织中的表达。p-P62(Thr/Ser272)的表达量在脊髓和胫神经中均比对照组高；p-ULK1(Ser556)的表达量在脊髓和胫神经中均比对照组低；p-Beclinl(Thr119)的表达量在脊髓中呈下降趋势,在胫神经中早期呈下降趋势晚期恢复到正常水平。4.PMSF干预组染毒动物神经组织中自噬相关蛋白p-P62(Thr/Ser272)、 p-ULK1(Ser556)、p-Beclin1(Thr119)的变化：PMSF干预后发现p-P62(Thr/Ser272)、 p-ULK1(Ser556)、p-Beclin1(Thr119)的水平在实验周期内未见减少,p-P62 (Thr/Ser272)在脊髓中的表达量与对照组相比没有统计学差异,在胫神经中的表达量均比对照组高；p-ULK1(Ser556)的表达量在脊髓中未见明显变化,在胫神经中仅在0天有所增加在其他时间点均正常表达；p-Beclin1(Thr119)的表达量在脊髓和胫神经中均比对照组高。结论1.TOCP染毒影响了自噬相关蛋白Beclin1、ULK1和P62的表达及其磷酸化程度。2. PMSF能有效预防OPIDN的发生,并能逆转TOCP诱导的自噬相关蛋白变化。3. OPIDN发生可能与TOCP染毒影响了神经元的自噬活性有关。