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研究背景:孤立性肺结节(solitary pulmonary nodules,SPN)是指单一的、边界清的、直径不大于3.0cm的、病变周围完全由含气肺组织所包绕的肺部结节样病变,没有肺门增大、肺不张或胸腔积液等情况。影像学表现为密度增高或者磨玻璃样的阴影,以及有上述两种成分同时存在的混合性结节。随着低剂量螺旋CT(Low-dose spiral CT,LDCT)的普及,越来越多的人接受肺部筛查体检,肺结节患者的检出率逐年增加。绝大多数患者无法从肺结节的常规检测中获得重要信息,也就是无法有效的区分良恶性。对肺结节的评估方法主要包括临床信息、影像学、肿瘤标志物、组织活检病理和临床肺癌概率等。其中组织活检病理为金标准,但创伤较大。最能被患者接受的是相关肿瘤标志物监测,但其灵敏度相对较低,容易产生假阴性。因此,需要进一步研究开发和验证新的无创性生物学标志物,增加诊断灵敏度并判断预后的准确性。外周血循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells,CTCs)是指自肿瘤瘤体脱落进入外周血循环的肿瘤细胞。运用靶向PCR技术监测细胞表面叶酸受体(Folate receptor,FR)的CTCs检测灵敏度比其他CTCs检测方法以及常规肿瘤标志物高,可达到80%以上,对于Ⅰ期肺癌的检出率更是可以达到67.2%左右,故对早期肺癌的辅助诊断有一定的参考价值。同时循环肿瘤DNA(Circulatingtumor DNA,ctDNA)作为一种特征性的肿瘤生物标志物,可以被定性、定量和追踪,将在肿瘤的早期诊断、发展过程监测、预后判断以及个性化用药指导等方面发挥重要作用。研究方法:本论文受试者分为两个部分。第一部分为2016年9月-2017年6月在苏州大学附属第一医院治疗的孤立性肺结节患者80例。诊断明确后归入不同研究组。治疗前采集3mL全血样本进行CTCs检测,同时利用全自动化学分析仪检测糖类抗原 125(Carbohydrate antigen 125,CA125)、癌胚抗原(Carcino-embryonic antigen,CEA)、神经元特异性烯醇化酶(Neuro-specific enolase,NSE)、细胞角蛋白片段 21-1(Cytokeratinfragment,CYFRA21-1)、鳞状细胞癌抗原(Squamous cell carcinoma antigen,SCCA),分析外周血 CTCs 数量以及联合上述肺癌特异性肿瘤标志物与良恶性肺结节辅助诊断的相关性。由于目前肺腺癌多发,入组2016年9月-2017年6月苏州大学第一附属医院呼吸科、胸外科和肿瘤科就诊的肺腺癌患者120例,分析了外周血CTCs与肿瘤大小、肺腺癌亚型以及分期等之间的关系。第二部分为为第一部分研究中接受手术治疗,术前诊断为腺癌的患者30例。收集肿瘤样本、术前一周血液样本和术后一周血液样本,并使用靶向测序方法检测匹配肿瘤中的体细胞驱动基因突变。利用肿瘤DNA(tumor DNA,tDNA)和血浆ctDNA为样本,通过测序鉴定了术前术后血浆ctDNA和tDNA中的突变类型及突变频率,进行一致性分析,并对手术前后ctDNA突变频率进行分析以及ctDNA与肺癌肿瘤标志物灵敏性进行比较。研究结果:1.孤立性肺结节患者中肺恶性SPN 50例(62.5%),肺良性SPN 30例(37.5%),肺恶性SPN患者CTCs水平为9.79(8.98-10.60)单位,明显高于肺良性SPN患者CTCs水平6.66(5.81-7.51)单位,差异有统计学意义(P<0.001)。2.以肺SPN良恶性为因变量,各因素为自变量进行多因素Logistic回归分析,得到的结果显示结节最大径、CEA、CTCs水平为肺恶性SPN的独立危险因素(P<0.05)。3.肺腺癌SPN组CTCs水平为10.65(9.93-11.37)单位。肺良性SPN组CTCs水平为6.66(5.81-7.51)单位。采用Mann-Whitney U检验结果显示,肺腺癌SPN组的CTCs水平高于肺良性SPN组,差异有统计学意义(P<0.001)。4.在肺腺癌患者中,原发肿瘤最大径>2.0cm患者外周血CTCs水平高于最大径≤2.0cm患者,差异有统计学意义(P=0.001)。Ⅲ-Ⅳ期肺腺癌患者外周血CTCs的水平高于Ⅰ-Ⅱ期肺腺癌患者,差异有统计学意义(P=0.000)。在不同的病理学亚型中,微浸润腺癌和浸润型腺癌患者外周血CTCs的水平均高于原位腺癌患者,差异有统计学意义(P=0.03,P=0.002)。5.以肺良性SPN和肺腺癌SPN为因变量,CTCs及临床生物标志物为自变量进行多因素Logistic回归分析,结果显示CTCs与CEA为肺腺癌的独立危险因素(P=0.021,P=0.001。6.以全部肺癌患者作为病例组,肺良性SPN患者作为对照组,绘制ROC曲线。利用尤登指数(Youden)来寻找最佳cutoff值为8.35,取8.35个单位作为cutoff值来进行诊断,此时全部肺癌患者的诊断敏感性为70.2%,特异性为79.3%。7.肿瘤组织tDNA对比术前血浆ctDNA突变情况比较,阳性一致10例及阴性一致12例共有22例患者保持结果一致,一致率为73.33%,敏感性为76.92%(95%CI 49.74%-91.82%),特异性为70.59%(95%CI 46.87%-86.72%)。8.肿瘤组织tDNA对比术后血浆ctDNA突变情况比较,阳性一致5例及阴性一致15例共有20例患者保持一致,一致率为66.67%,敏感性为38.46%(95%CI 17.71%-64.48%),特异性为 88.24%(95%CI 65.66%-96.71%)。9.所有18例有突变的肺腺癌患者中,突变基因类型有四种,分别为EGFR(13/18,72.21%)、KRAS(3/18,16.67%)、MET(1/18,5.56%)、BRAF(1/18,5.56%)。18例患者手术前血浆ctDNA平均突变频率为4.53%(0.00-26.44%),手术后血浆ctDNA平均突变频率为0.61%(0.00-5.68%),将两组数据进行对比分析,术后血浆ctDNA平均突变频率较术前明显降低,有统计学意义(p=0.0408)。其中有15例患者(83.33%)手术后血浆ctDNA平均突变频率较术前降低,降低平均突变频率为4.81%(0.001-26.42%),2例(11.11%)血浆ctDNA突变频率手术前后无变化,1例(5.56%)血浆ctDNA突变频率较术前增加。10.术前ctDNA突变率与年龄、性别、吸烟史无明显相关性(p>0.05);与其他血清肿瘤生物标志物相比,ctDNA对肺结节引发的肺腺癌具有更高的灵敏度。研究结论:CTCs联合CEA两项肿瘤标志物及结节最大径可提高恶性孤立性肺结节患者的诊断效能。CTCs的检测数量结果可反应肺腺癌患者的体内肿瘤负荷,可作为评估患者病理亚型严重程度以及癌症分期的一项辅助指标,也可作为治疗效果的一项评估指标。术前、术后ctDNA与tDNA检测结果均有较高的一致性,为一些由于种种原因不能取到肿瘤标本的患者带来了基因检测的机会。靶向测序检测ctDNA可以检测出肺腺癌患者的突变基因及突变频率,指导靶向治疗药物的选择,并可反映患者手术治疗的效果,具有一定的可靠性。CTCs,ctDNA可作为一种新型的肿瘤标志物,其有创伤小,可重复性等优点,在孤立性肺结节患者的诊断、治疗及预后等方面发挥重要作用。