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背景和目的:在许多国家,肺癌是因癌症导致死亡的主要原因。由于早期肺癌缺乏症状,大约70%-80%的肺癌患者在确诊时已是晚期。大多晚期肺癌患者均接受铂类为基础的化疗,但是目前一线化疗疗效十分有限。而且非小细胞肺癌二线治疗的有效率并不理想,PFS仅在3个月。随着NSCLC分子发病机制逐渐阐明,针对这些分子发病机制的分子靶向治疗已成为了可能。目前NSCLC分子靶点治疗多集中在肿瘤细胞的表皮生长受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)上。其抑制剂(EGFR TKI)是一种受体酪氨酸激酶抑制剂,它与ATP竞争表皮生长因子受体特定结合位点,从而抑制酪氨酸酶的活性,在临床上已用于EGFR活化突变的非小细胞肺癌的患者的治疗。但很多患者在用药一段时间后,即出现耐药现象,甚至是病情加重。针对这种药物耐药机制的研究已成为近几年来研究的热点。目前关于耐药机制研究比较成熟的有EGFR T790M突变和c-met原癌基因的扩增。最近的研究表明整合素可调节上皮细胞粘附于细胞外基质(extracellular matrix, ECM)蛋白,诱导酪氨酸磷酸化,部分激活EGFR,而EGF也能提高整合素α2β1的表达。分析PC9细胞株以及在此基础上吉非替尼诱导的耐药细胞株时发现,大部分耐药株胶原的粘附能力远高于PC9,提示细胞粘附分子和细胞外基质可能参与吉非替尼的耐药[。另有研究发现分析PC9以及耐药细胞株发现,耐药细胞株整合素β1水平显著增高,整合素β1可能与吉非替尼获得性耐药有关本研究组旨在通过分析PC9细胞株基础上建立稳定表达整合素β1的亚细胞株PC9/D6以及空载体转染细胞株PC9/PCD,进一步从体内或体外水平进一步证实整合素β1表达上调影响吉非替尼的敏感性以及免疫组化检测移植瘤组织中蛋白的表达水平,更好地了解整合素β1是如何影响EGFR TKI的敏感性,为寻找新的耐药机制提供有力的依据。第一部分整合素β1表达上调对吉非替尼抑制细胞增殖的影响目的:评价三株NSCLC细胞株PC9(EGFR突变性)以及在此基础上脂质体稳定转染整合素β1细胞株PC9/D6和脂质体pcDNA 3.1稳定转染空白对照株PC9/PCD对吉非替尼的疗效,探讨整合素β1表达上调与吉非替尼耐药的关系。方法:PC9、PC9/PCD和PC9/D6三株细胞经0.5μmol/L吉非替尼作用后,用MTT法检测三株细胞不同时间点的细胞增殖情况。结果:1.吉非替尼对肺腺癌PC9细胞株有明显的抑制作用,并且这种抑制作用呈现出时间依赖性(P<0.05)2.吉非替尼对空白对照株PC9/PCD有明显的抑制作用,且这种抑制作用呈现出时间依赖性(P<0.05)。且PC9细胞株和PC9/PCD细胞株在相同时间点细胞增殖率并没有统计学差异。3.吉非替尼对高表达整合素β1细胞株PC9/D6的抑制作用明显减弱。与PC9细胞株和PC9/PCD细胞株比较发现,在不同时间点PC9/D6细胞株的增殖率与前两株细胞相比均具有明显统计学差异(P<0.01),说明整合素β1表达的上调降低了细胞株对吉非替尼的敏感性。,但是吉非替尼仍能部分抑制PC9/D6细胞增殖,可见整合素β1可能参与了吉非替尼的部分耐药。第二部分整合素β1表达上调对吉非替尼抑制肿瘤生长的影响目的:探讨整合素β1表达上调对吉非替尼抑制肿瘤生长的影响。方法:建立PC9、PC9/PCD、PC9/D6三株细胞的裸鼠移植瘤模型,同时设治疗组和对照组(3mg/kg吉非替尼和1%Tween-80),观察肿瘤的生长情况,描绘肿瘤生长曲线,至疗程结束,剥离肿瘤组织,称瘤重,同时计算抑瘤率。结果:1.吉非替尼对PC9细胞株裸鼠移植瘤模型有明显的抑制作用。至疗程结束,其治疗组和对照组的瘤重分别是(71.7±8.12)mg,(1364.86±259.173)mg,抑瘤率为95.16%。2.吉非替尼对PC9/PCD细胞株裸鼠移植瘤模型抑瘤作用明显。至28天疗程结束后,其抑瘤率为93.54%3.吉非替尼对PC9细胞株裸鼠移植瘤模型抑瘤作用相对较弱,且即使在给予吉非替尼治疗的同时,治疗组裸鼠移植瘤仍处于生长状态,只是相对于对照组而言,生长的速度延缓。与PC9和PC9/PCD治疗组比较,具有统计学差异(P<0.05)。第三部分移植瘤形态学检查及其组织中整合素β1、EGFR、pEGFR的表达情况目的:观察治疗组和对照组移植瘤形态学变化,检测组织中整合素β1、EGFR、pEGFR的表达情况.方法:剥离的肿瘤组织经4%的多聚甲醛固定,病理切片,同时取部分切片经苏木精-伊红染色;余切片采用免疫组化法检测整合素β1、EGFR、pEGFR的表达情况。结果:1.PC9、PC9/PCD治疗组与对照组相比,肿瘤细胞的排列较疏松,细胞核明显淡染。但PC9/D6组治疗组与对照组相比,肿瘤细胞仍较密集,细胞核未见明显淡染。2.整合素β1在PC9/D6组的表达强度明显高于PC9及其空白对照株PC9/PCD(P<0.01),而三株细胞移植瘤治疗组与对照组相比,其整合素β1表达无统计学差异。三株细胞移植瘤中的EGFR表达无统计学差异,与是否给与吉非替尼处理无关。三株细胞移植瘤在接受吉非替尼治疗后,pEGFR均有不同程度的下降,对照组与治疗组比较有统计学差异(P<0.01)。而pEGFR在治疗组PC9/D6表达强度明显高于PC9, PC9/PCD(P<0.01)。结论:转染了整合素β1的细胞PC9/D6细胞增殖率明显高于PC9/PCD和PC9组。吉非替尼对PC9/D6裸鼠移植瘤生长抑制最不明显,抑制率是61.38%,与PC9/PCD、PC9组比较具有明显统计学差异, PC9/PCD、PC9的抑制率分别是93.54%,95.16%。PC9/D6裸鼠移植瘤中整合素β1的表达高于PC9/PCD,PC9。而EGFR在三者之间表达无统计学差异。三组裸鼠移植瘤经吉非替尼治疗后, pEGFR的表达均有不同程度的下降,但PC9/D6治疗组pEGFR的表达组显著高于PC9/PCD、PC9。无论体内或体外实验,整合素β1表达上调降低了细胞株或移植瘤对吉非替尼的敏感性。提示整合素β1可是一种新的耐药机制参与了EGFR TKI的耐药。