各种原因导致阴道缺失的患者需要进行阴道成形术，传统手术存在着牺牲正常组织、遗留瘢痕、免疫排斥等问题。组织工程技术为阴道重建提供理想的组织衬里，并且重建的阴道有理想的深度和宽度，弥补了传统手术形成的人工阴道在形态和功能上的不足。种子细胞是进行组织工程化组织构建的最为关键的要素，只有获得足够数量并保持特定生物学活性的种子细胞，才能保证组织构建的成功。目前阴道组织工程的种子细胞大都采用自体组织的同源细胞，但是存在着来源有限、细胞易老化、不能大规模扩增以及细胞取材对机体造成新的创伤等不足，因此，骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)向上皮细胞的诱导分化是其在阴道组织工程中应用的关键步骤。本研究尝试应用大鼠口腔黏膜上皮细胞体外诱导骨髓间充质干细胞向上皮细胞诱导分化，为BMSCs作为种子细胞应用于阴道组织工程奠定基础。第一部分原代培养大鼠口腔黏膜上皮细胞的研究目的：探讨大鼠口腔黏膜上皮细胞体外培养方法，以应用于诱导BMSCs向上皮细胞分化的研究。方法：取大鼠口腔黏膜组织，分别用PBS配制的0.6U/ml的DispaseⅡ和D-KSFM配制的0.6U/ml的DispaseⅡ，D-KSFM配制的0.6U/ml的DispaseⅡ和D-KSFM配制的1.2U/ml的DispaseⅡ，记录每组上皮分离结果的评分及可获活细胞数，倒置相差显微镜下观察首次换液时细胞贴壁情况；分别用胰酶消化10min×二次和20min×一次方法，用KBM-GOLD培养基和含6%FBS的KBM-GOLD培养基培养，记录每组上皮可获活细胞数，倒置显微镜观察细胞形态，扫描电镜观察细胞超微结构，免疫组化及免疫荧光鉴定。结果：PBS配制组与D-KSFM配制组相比，两者分离结果评分基本一致，无统计学差异(P=1.0>0.05)，可获活细胞数小于D-KSFM配制组，两组之间无统计学差异(P>0.05)，首次换液时可见D-KSFM配制组贴壁细胞较多；1.2U/ml组与0.6U/ml组相比，上皮层更易完整分离，分离结果评分及可获活细胞数更高，有统计学意义(P=0.025<0.05;P=0.036<0.05)；胰酶消化10min×二次组可获活细胞数高于20min×一次组，差异无统计学意义(P=0.388)，首次换液时倒置显微镜下观察胰酶多次消化组贴壁细胞更多；大鼠口腔黏膜上皮细胞在KBM-GOLD培养基中48h可见成簇贴壁细胞，3-6天细胞稍增多，7-8天逐渐融合，呈铺路石样外观，在含6%FBS的KBM-GOLD培养基中生长快，4-6天可达约85%融合，但夹有长梭形的成纤维细胞，上皮细胞形态发生改变。倒置显微镜下见上皮细胞呈不规则圆形或多边形，连接成片后似铺路石状。扫描电镜下细胞表面可见微绒毛嵴。广谱角蛋白AE1/AE3免疫组化染色为阳性，免疫荧光示胞浆红色。结论：依次使用D-KSFM配制的1.2U/ml的DispaseⅡ和胰酶消化10min×二次，在KBM-GOLD培养基中可获得更多的口腔黏膜上皮细胞，并显示上皮细胞特征。第二部分体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向上皮细胞分化的研究目的：探讨大鼠口腔黏膜上皮细胞体外诱导BMSCs向上皮细胞分化的培养方法，为BMSCs作为种子细胞应用于阴道组织工程提供依据。方法：取大鼠口腔黏膜组织，用DispaseⅡ和胰酶分步消化，获取上皮细胞，接种于Transwell insert小室，取第三代至第五代生长良好BMSCs以3×10~3/cm~2（共培养14天）和5×10~3/cm~2（共培养7天）接种于六孔板，静置培养贴壁后，与在Transwell insert小室中培养2天的大鼠口腔上皮细胞共培养，加入含3%FBS的KBM-GOLD培养基中诱导培养，共培养14天的transwell insert小室在第8天时更换一次。每天在倒置显微镜下观察形态学变化，分别在共培养的第7、14天，通过免疫组织化学和western blot鉴定上皮细胞特异性标志物广谱角蛋白的表达。结果：诱导初期细胞成长条梭型，大小均一，无明显突起，当共培养第7天时，少量细胞变成圆形或椭圆形，周围有短的绒毛样突起，核呈圆形或椭圆形，胞浆丰富，AE1/AE3染色后部分细胞为阳性，胞浆呈棕黄色颗粒；诱导培养14天时，圆形或椭圆形细胞明显增多，AE1/AE3阳性表达细胞明显增多，并且细胞排列方式发生了变化，诱导后的细胞排列不规则或聚集成团。western blot结果显示诱导后的细胞有广谱角蛋白表达，并且14天时表达水平比7天明显增加。结论：体外大鼠口腔上皮细胞与BMSCs非接触共培养时，应用含有3%FBS的KBM-GOLD培养基可以诱导其向上皮样细胞分化，有望成为阴道上皮细胞的替代细胞而应用于组织工程化阴道的构建。