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植物的营养储存蛋白(vegetative storage proteins，VSP)被认为是一种存在于植物营养组织中的氨基酸或氮源的临时储存形式,它们表达量丰富,在植株其他部位需要营养时(如种子形成时)被降解,以满足植物生长发育的需要,大豆(soybean)中的VSPα和VSPβ是这类蛋白中发现最早和研究最多的。VSP1和VSP2是在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中发现的大豆VSP的同源蛋白,虽然还没有它们作为临时营养储存功能的报道,但它们与大豆VSP蛋白的氨基酸序列同一性达到40％,并且具有相同的表达调控模式,也能与大豆VSP的抗体相互作用。根据氨基酸序列的对比分析,拟南芥的VSP1和VSP2属于HAD家族(the haloacid dehalogenase superfamily)中的酸性磷酸酶,具有特征序列DXDXT。同时,VSP1和VSP2也是一种植物防御蛋白,参与了茉莉素诱导的植物防御的信号途径,在植物对抗植食性昆虫和病原菌的侵害中发挥重要作用。有文献报导重组表达的VSP2具有抗虫活性,而且这种抗虫活性与其酸性磷酸酶的活性相关。因此利用分子生物学等手段克隆出拟南芥VSP蛋白的基因,实现拟南芥VSP蛋白的高效异源活性表达,进行蛋白晶体结构与催化机制的研究,是进一步了解VSP蛋白在植物防御中如何发挥作用的重要基础。 本研究利用分子生物学手段从拟南芥cDNA文库中扩增得到拟南芥VSP蛋白的编码序列,并将获得的VSP基因构建到原核表达载体pET22b上并在大肠杆菌BL21菌株中得到高效可溶性表达。将得到的重组VSP蛋白进行Ni-NTA亲和层析分离纯化,可获得电泳纯的重组VSP蛋白。从1L大肠杆菌LB培养液中经过离心破碎,亲和层析后能得到约12mg左右的纯蛋白。将得到的电泳纯的蛋白除盐透析后,以pNPP为底物检测,发现两种重组VSP蛋白都具有酸性磷酸酶活性。规定一个酶活单位为37℃在1min内能转化1μmol底物的酶量。VSP1和VSP2的比酶活为7.21 U/mg和8.15U/mg。VSP1和VSP2的最适pH为4.5,最适温度为37℃,酸性磷酸酶活性受Cu2+影响最大。重组蛋白表达量高,纯化后均一性好,适于蛋白晶体生长。