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谷氨酸棒杆菌的突变菌株被广泛应用于L-谷氨酸、L-赖氨酸和L-苏氨酸等氨基酸以及其他代谢产物的生产,对谷氨酸棒杆菌快速引入突变、提高其育种效率的需求越来越高。单链寡核苷酸(ssDNA)介导的同源重组技术可以实现基因组上多重位点的同步编辑,相比传统的育种技术更加高效。但由于较低的重组效率,该技术在谷氨酸棒杆菌中尚未成熟应用,提高ssDNA在其中的重组效率十分必要。本论文研究对象为Corynebacterium glutamicum ATCC 13032,通过优化ssDNA的电转效率以及重组酶表达系统来提高ssDNA在谷氨酸棒杆菌中的重组效率。本文主要研究结果如下:(1)以C.glutamicum ATCC 13032为宿主系统,通过单因素实验选取一个较优的感受态基础培养基,在此基础上通过单因素实验结合响应面分析对感受态培养基中添加的四种细胞壁弱化剂进行组合优化,最终得到一个较优的感受态培养基,使外源DNA电转化效率提高了108倍,达到3.1×106 cfu/μg质粒DNA。进一步通过单因素实验分别对细胞生长状态、电转缓冲液、电激参数、热激条件、质粒添加量及后培养时间等进行优化,使外源DNA在C.glutamicum中的电转化效率提高了11倍,最终得到质粒在谷氨酸棒杆菌中的电转化效率为3.81×107 cfu/μg质粒DNA,ssDNA电转化效率为5.6×104cfu/109活细胞。(2)以C.glutamicum ATCC 13032为宿主系统,以ssDNA修饰的rpsL基因为靶基因,对ssDNA的使用长度、浓度和硫代磷酸碱基修饰等进行优化,对比rpsL自发突变率,筛选出最优ssDNA碱基长度为90 nt,最优添加浓度为10μg/80μL感受态细胞;进一步在3’端加入两个硫代磷酸碱基修饰,最终优化得到ssDNA同源重组效率为9.8×104cfu/109活细胞,相比于优化前提高了1.75倍。(3)以C.glutamicum ATCC 13032为出发菌株,构建了13032/pDXW-10-recT菌株,通过质粒pDXW-10在谷氨酸棒杆菌中组成型表达Escherichia coli来源的重组酶RecT,ssDNA重组效率提高1.7倍,达到1.67×105 cfu/109活细胞;为了进一步提高重组酶RecT的表达量,以13032为出发菌株,构建了T7启动子介导的诱导表达系统13032-DE3/pJC1-T7-recT,通过IPTG诱导,T7启动子下重组酶RecT表达量得到提高,ssDNA重组效率达到7.8×105 cfu/109活细胞,相比13032/pDXW-10-recT菌株ssDNA重组效率提高了4.7倍,相比谷氨酸棒杆菌原始菌株ssDNA重组效率提高了8倍;在此基础上进一步构建基因组整合表达的13032-DE3 Zif’::T7-recT菌株,获得ssDNA重组效率为6.7×105 cfu/109活细胞,在保证ssDNA重组效率的同时摆脱了游离质粒和抗生素筛选标记的使用,大大提高了谷氨酸棒杆菌改造的便捷性和可操作性。(4)优化后谷氨酸棒杆菌同源重组效率的评价:利用谷氨酸棒杆菌在rpoB基因及gyrA基因上的单点突变对优化后的ssDNA同源重组系统进行评价,得到的ssDNA重组效率分别为5.6×106 cfu/109活细胞及2.3×107 cfu/109活细胞。结果表明该方法对rpoB基因和gyrA基因同样适用。