转il-4基因甘蓝(Brassica Oleracea L.)的T3、T4代分子检测及il-4遗传与表达研究

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将il-4基因利用农杆菌介导的方法导入中甘11号甘蓝(Brassica oleracea L.)种子,本研究以其自交后代的T3、T4代为试验材料,对转il-4基因中甘11号甘蓝的T3、T4代进行抗性筛选、PCR扩增检测及PCR-Southern杂交等分子水平检测,对T3、T4代自交甘蓝中il-4基因的传递规律进行研究;同时对已经检测的自交后代阳性株不同株系间进行杂交,对T3、T4代自交及杂交甘蓝进行ELISA和Western杂交等蛋白水平检测,测定蛋白表达量后进行讨论。试图对已经检测的自交后代阳性株进行不同株系间杂交,得到杂种子代,检测是否能够提高后代阳性率和蛋白表达量。另外,通过对单荚结籽数、出苗率、成活率、抗病性等方面数据对甘蓝阳性后代进行育苗调查。  本研究中,共播种il-4基因T3代种子1066粒,实际出苗561株,成活366株。PCR检测中,待测样品366株,检测得到il-4阳性株17株,阳性率为4.6%。T4代种子共播种789粒,实际出苗582株,成活467株。PCR检测中,待测样品467株,检测得到il-4阳性株23株,阳性率为4.92%。待测杂交F1代幼苗60株,进行PCR检测得到阳性株2株,阳性率为3.33%,实验结果均远远低于理论值。对转il-4基因T3、T4代阳性植株单荚结籽数、出苗率、成活率、抗病性等生理指标与阴性植株进行比较,结果表明阴性植株各项生理指标均高于阳性植株。  随机抽取10株从PCR检测为阳性的植株作为样品进行PCR-Southern杂交,结果显示10株中有8株为阳性,表明转化后代中存在外源基因il-4。ELISA检测时,对T3、T4代包括杂交株在内的10个株系的36个PCR阳性株作为样品进行蛋白水平检测。结果表明,T3代 CP249-2-59-45占其总可溶性蛋白的含量较高为0.334%,其余部分样品表达量较低。同一株系内各株间IL-4的表达量具有一定差异。为了检测ELISA实验结果的可靠性,选取外源基因产物IL-4表达水平较高的样品进行Western杂交。实验结果表明,部分样品出现目的条带,证明了IL-4在转基因甘蓝后代中能够进行正常表达。
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