PRMT5(Protein arginine methyltransferase 5),即蛋白精氨酸甲基化转移酶5,它属于II型甲基化转移酶,可以对称性地甲基化组蛋白或者非组蛋白底物的精氨酸残基,通过表观遗传的方式调控靶基因的表达或通过翻译后甲基化修饰途径调节关键的信号分子。最近的研究表明,PRMT5在许多人类肿瘤如肺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、乳腺癌、黑色素瘤、白血病或淋巴瘤及恶性胶质瘤中呈高表达,且其高表达水平直接与肿瘤的进程及预后差密切相关。值得注意的是,敲低PRMT5可以抑制这些肿瘤细胞的增殖或诱导细胞凋亡,这些研究表明PRMT5可能是潜在的癌基因。然而,肿瘤中PRMT5的表达如何被调控在很大程度上并不清楚。因此,本研究旨在从转录及翻译后水平探讨肿瘤细胞中PRMT5高表达的调控机制。第一,我们从转录水平探讨肿瘤细胞中PRMT5高表达的调控机制。Hu实验室的前期观察表明,PRMT5在前列腺癌组织中呈高表达。因此,为了进一步研究PRMT5在前列腺癌中的转录激活机制,我们选择前列腺癌最常见的三个细胞系LNCa P,PC-3及DU 145细胞进行实验。首先证明在LNCaP细胞中PRMT5的启动子是杂合子,不同的等位基因(allele)之间具有不同的SNPs(Single Nucletide Polymorphisms)及13 bp Indel(Insertion/Deletion Polymorphisms)基因多态性。接着,我们利用双荧光素酶报告基因(Dual-Luciferase Reporter Gene)鉴定找到PRMT5的核心启动子位于-240 bp区域以内,并用EMSA(Electrophoresis Mobility Shift Assay)、ChIP(Chromatin Immunoprecipitation)、定点突变、删减突变等分子生物学方法从多个角度证明,在多个肿瘤细胞系中转录因子NF-Y(Nuclear Factor Y)结合到PRMT5核心启动子的CCAAT盒上进而调控PRMT5的转录激活。另外,我们发现下调PRMT5的表达所导致的细胞增殖抑制直接与NF-YA的敲低有关。更重要的是,研究结果证明PKC-c-Fos信号通路可以通过下调NF-YA的表达而抑制PRMT5的转录。鉴于多个PKC(Protein Kinase C)家族的成员被报道在某些肿瘤中表达水平下调,我们推测PKC-c-Fos信号通路的失活可能与某些肿瘤病人中PRMT5的高表达有关,而深入研究PRMT5如何与PKC/c-Fos信号通路的相互交叉将为进一步阐释PRMT5促肿瘤发生的角色提供理论依据。第二,我们从翻译后修饰水平探讨PRMT5蛋白表达的调控机制。基于上面的结果及我们未发表的发现,我们推测PRMT5自身可以被翻译后修饰。为此,使用Co-IP(Co-Immunoprecipitation)及WB(Western blot)技术证实PRMT5蛋白可以发生多聚泛素化翻译后修饰。通过Co-IP及定点突变,证实PRMT5上的多个赖氨酸位点对于PRMT5的多聚泛素化修饰均很重要。接着,使用MS(Mass Spectrometry)、Co-IP、GST下拉、亚细胞共定位、BiFC、定点突变、删减突变等分子生物学方法,我们找到并证明CHIP(Carboxy terminus of Heat shock cognate 70-Interacting Protein)是与PRMT5相互作用的E3连接酶,后者可以与分子伴侣(chaperones)系统如热休克蛋白90及70(Hsp90/Hsp70)发生相互作用,进而通过泛素化依赖的蛋白酶体降解方式调控PRMT5/MEP50(Methylosome protein 50)的表达。另外,我们的结果显示Hsp90的抑制剂如GA(Geldanamycin)或17-AAG(17-(Allylamino)-17-demethoxygeldanamycin)介导的PRMT5下调依赖CHIP E3连接酶介导的蛋白酶体降解机制,且17-AAG可以协同过表达CHIP对PRMT5表达的抑制作用及诱导细胞凋亡的效应。这些发现提示在肿瘤组织中CHIP表达水平的下调可能与PRMT5的高表达水平相关。最后,我们证明靶向PRMT5联合17-AAG干预可作为一个新的方法抑制肿瘤细胞的生长。综上所述,我们探讨了PRMT5的转录及翻译后修饰的调控机制。研究结果表明,转录因子NF-Y对激活PRMT5的转录很关键,且NF-Y的转录活性受到PKC/c-Fos信号通路的负调控。另一方面,E3连接酶CHIP与分子伴侣系统相偶联,介导PRMT5翻译后的泛素化修饰及蛋白酶体依赖的降解。这些研究将为促进靶向PRMT5及其上游相关信号分子的抗癌治疗提供理论和实验依据,为新抗癌药物的研发奠定基础。