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以巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)为研究对象,经原核系统表达得到高纯度目的蛋白,采用紫外分光-光度法建立高通量筛选模型,并利用此模型筛选出潜在的小分子抑制剂,通过蛋白晶体结构解析进行结构生物学研究。本实验将人源MIF基因与载体质粒pET-22b进行重组质粒构建,通过转化,借由大肠杆菌DH5α进行质粒扩增、回收,之后进行测序、双酶切鉴定等验证重组质粒构建是否成功。将构建成功的重组质粒转化到大肠杆菌BL(21)感受态细胞中,进行诱导表达,利用离子亲和层析和排阻色谱层析对目的蛋白进行纯化。建立以蛋白MIF为靶点,HPP为底物的高通量药物筛选模型,并对384种小分子进行筛选。利用悬滴式气相扩散法进行MIF蛋白、MIF蛋白与小分子的结晶实验,对结晶条件进行优化和筛选,对MIF单晶、共晶进行X-射线衍射,进行数据收集、处理,以期获得MIF单晶、MIF与小分子的三维结构。pET-22b-MIF重组质粒构建成功;原核系统表达大肠杆菌表达系统表达,后期纯化,最终获得高纯度的MIF蛋白(纯度>96%);成功构建以MIF蛋白为靶标的高通量药物筛选模型,并从384种小分子成功筛选出3种小分子,测定3种小分子的半数抑制浓度(IC50)分别为 59.07μmol/L、91.02μmol/L、44.12μmol/L。MIF 蛋白单晶实验经过优化,最终得到最佳结晶条件:MIF蛋白浓度18mg/ml,硫酸铵浓度为1.8mol/L,温度37℃。对MIF蛋白晶体进行X-射线衍射,收集晶体数据,进行处理分析,成功得到MIF单晶衍射数据:衍射分辨率为1.78 A,经数据分析,得知该蛋白晶体所属的空间群为P212121,晶胞参数为a=97.40A,b=156.73A,c=169.10A,α=90°,β=90°,γ=90°。三维显示MIF蛋白为三聚体,且第一位氨基酸为脯氨酸,证明其活性位点暴漏,适合进行与小分子的共晶实验。小分子DOPAC与MIF蛋白进行共晶实验,筛选出最佳结晶条件:MIF蛋白与DOPAC摩尔比为1:10,点晶复合物浓度21mg/ml,硫酸铵浓度2.0mol/L,温度37℃。通过X-射线衍射获得结构数据,进行处理分析,得到理想的共晶衍射数据:衍射分辨率为1.78 A,经数据分析,得知该蛋白晶体所属的空间群为P222,晶胞参数为a=44.76,b=70.92,c=96.01,α=90°,β=90°,γ=90°。MIF_DOPAC 三维结构显示小分子 DOPAC与MIF蛋白的共晶三维结构显示MIF单体第一位脯氨酸(Pro1)与小分子DOPAC共价结合,与95位酪氨酸(TYR-95)的苯环形成π-π堆积,与32位赖氨酸(SER-32)、63位丝氨酸(SER-63)、97位天冬酰胺(ASN-97)具有氢键作用。实验结果证明小分子DOPAC具备作为先导化合物分子进行后期药物开发潜能。