论文部分内容阅读
目的:为了确定科罗索酸（Corosolic acid,CRA）治疗是否可以减轻心肌梗死（myocardial infarction,MI）后心肌纤维化,我们通过对持续喂食CRA的C57 BL/6J小鼠行左冠状动脉前降支结扎术构建心肌梗死模型,通过动物实验评估CRA对梗死后小鼠的心脏功能和心肌纤维化的影响以及氧化应激和巨噬细胞的变化,在离体细胞实验中进一步探讨其可能存在的作用机制,以期为改善心脏梗死后纤维化寻找新的治疗策略。方法:动物实验部分选取80只6-8周龄的雄性C57BL/6J小鼠（23.5-27.5g）,所有小鼠在适应实验室环境至少一周后随机分配到对照组（磷酸盐缓冲盐水治疗）和不同浓度CRA药物治疗组（低剂量组和高剂量组）,经过14天药物干预,小鼠接受假手术或冠状动脉左前降支结扎术构建心肌梗死模型,最终小鼠被分为四组:假手术组、心梗组、实验组（10mg/kg和20mg/kg）。术后四周,超声检测各组小鼠心脏短轴缩短率（fractional shortening）、射血分数（ejection fraction）,血流动力学检测每搏出量（Stroke Volume,SV）及心输出量（Cardiac output,CO）,评估小鼠心功能改变。采用心脏组织石蜡切片做苏木素-伊红（HE）染色观察小鼠心脏组织形态学改变,苦味酸-天狼星红（PSR）染色观察小鼠心脏梗死后胶原沉积状况。免疫组化染色观察血红素氧合酶1（HO-1）和NADPH氧化酶4（Nox4）改变用以评估氧化应激水平,CD68染色观察各组边缘区和梗死区巨噬细胞数量差异用以评估炎症水平,TUNEL免疫荧光染色评估心肌组织中细胞凋亡状况。提取心脏组织RNA,采用实时定量PCR（Real Time-PCR）技术检测心房利钠肽（ANP）、脑利钠肽（BNP）、α-肌球蛋白（α-MHC）、β-肌球蛋白（β-MHC）、I型胶原（CollagenⅠα）、III型胶原（CollagenⅢα）、结缔组织生长因子（CTGF）、纤维连接蛋白（Fibronectin,FN）、HO-1、Nox4和NADPH氧化酶2（Nox2）。提取心脏组织蛋白采用Western Blotting方法检测转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）及Smads信号通路改变评估纤维化改变,检测HO-1、Nox2和Nox4评估氧化应激水平,检测细胞表面趋化因子受体2（C-C chemokine receptor-2,CCR2）和单核细胞趋化蛋白-1（mono-cyte chemotactic protein-1,MCP-1）评估巨噬细胞浸润程度。细胞实验采用H9C2细胞给予不同浓度CRA治疗（1μM,5μM和10μM）,放入三期培养箱中缺氧培养24小时,Western Blotting检测HO-1、Nox2、Nox4以及凋亡相关蛋白Bcl-2和C-caspase3的表达水平,在24孔板中采用2,7-二氯二氢荧光素（2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA）染色观察细胞活性氧水平,TUNEL荧光染色观察细胞凋亡状况。从新生大鼠心脏中分离出成纤维细胞,给予不同浓度CRA（1μM,5μM和10μM）治疗,使用100nmol/L血管紧张素Ⅱ（AngiotensinⅡ,AngⅡ）刺激24小时后,RT-PCR检测平滑肌激动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）、CollagenⅠα和CTGF的转录活性。结果:生存率曲线显示使用CRA治疗后的小鼠接受心肌梗死术后生存率较未经治疗的MI组小鼠显著提高（Figure 1A）;HE染色显示在MI组小鼠中发现大片梗死以及死亡的心肌细胞,而两组使用CRA治疗的小鼠心脏组织中梗死面积较MI组明显减少,并且存活心肌细胞数量明显增加（Figure 1B）;超声数据药物治疗组小鼠的短轴缩短率（低剂量组83%,高剂量组90%）较MI组（67%）增加（P<0.05）,并且呈剂量依赖性,MI组射血分数（EF%）降低（67%）,CRA治疗组EF明显改善,分别为74%和85%（P<0.05）（Figure 1C）;血流动力学检测结果显示,CRA治疗组每搏出量（SV）分别为（13.48±3.36）μl和（15.10±1.38）μl,其中高剂量组相较于MI组（11.44±2.00）μl明显提高（P<0.05）,同时高剂量组小鼠心输出量（CO）较MI组也明显增加（P<0.05）,数值分别为（6164.25±542.02）μl/min。（4212.94±1224.57）μl/min（Figure 1D）。PSR染色CRA药物治疗组相较于MI组存在更少的胶原沉积,并且在药物治疗组中的梗死区和边缘区中发现更多存活的心肌细胞（Figure 2A）。实时定量PCR检测显示心肌损伤标记物心房钠尿肽（ANP）、脑钠肽（BNP）、β-肌球蛋白（β-MHC）在MI组和CRA治疗组中转录增加,且各CRA治疗组转录水平低于MI组,α-肌球蛋白（α-MHC）在MI组和CRA治疗组中转录降低,且各CRA治疗组转录水平高于MI组,具体表现为:心房钠尿肽在MI组和各浓度CRA组分别升高（28.77±3.39）倍、（17.23±0.31）倍和（11.04±4.24）倍,CRA治疗组与MI组相比转录减少（P<0.05）;脑钠肽（BNP）升高倍数分别为（11.92±0.75）倍、（6.87±2.05）倍和（3.98±1.64）倍,CRA治疗组与MI组相比转录减少（P<0.05）;α-MHC在MI组和CRA治疗组中分别降低为（0.44±0.02）倍、（0.65±0.16）倍和（1.00±0.11）倍,MI组与CRA治疗组相比转录减少（P<0.05）;β-MHC在MI组和CRA治疗组中分别升高（194.32±24.93）倍、（25.76±10.93）倍和（32.20±19.45）倍,CRA治疗组与MI组相比转录减少（P<0.05）;纤维化标记物结缔组织生长因子（CTGF）、Ⅲ型胶原（CollagenⅢα）、Ⅰ型胶原（CollagenⅠα）、纤维连接蛋白（FN）转录水平在MI组和各CRA治疗组中增加,且各CRA治疗组转录水平低于MI组,具体表现为:CTGF升高倍数分别为（31.59±3.34）倍、（11.20±6.46）倍和（5.38±2.00）倍,CRA治疗组与MI组相比转录减少（P<0.05）;CollagenⅠα升高倍数分别为（14.23±1.46）倍、（11.07±5.11）倍和（5.88±0.24）倍,CRA治疗组与MI组相比转录减少（P<0.05）;CollagenⅢα升高倍数为（15.01±0.99）倍、（10.66±4.85）倍和（6.00±0.56）倍,CRA治疗组与MI组相比转录减少（P<0.05）;FN升高倍数为（15.30±1.43）倍、（4.05±3.05）倍和（5.33±0.30）倍,CRA治疗组与MI组相比转录减少（P<0.05）（Figure 2B）。Western Blotting结果显示心肌组织中TGF-β1/Smad信号通路在MI组和CRA治疗组中被激活,与MI组相比,各CRA治疗组中蛋白表达水平降低（P<0.05）（Figure 2C）,具体数值表现为TGF-β1增加倍数为（12.04±1.39）倍、（4.87±0.92）倍和（1.42±0.07）倍,p-Smad 2增加的倍数为（14.23±1.00）倍、（11.15±1.21）倍和（12.44±0.52）倍,p-Smad 3增加的倍数为（3.4±0.28）倍、（1.29±0.31）倍和（2.60±0.41）倍（Figure 2D）;Western Blotting检测AngⅡ刺激成纤维细胞后成纤维细胞中平滑肌激动蛋白（α-SMA）、Ⅰ型胶原和CTGF蛋白表达量在缺氧组和CRA治疗组中增加,与缺氧组相比,α-SMA和CTGF在5μM和10μM的浓度下降低（P<0.05）,I型胶原在1μM、5μM和10μM依次降低,表现出剂量依赖性。Western Blotting检测心肌梗死后氧化应激相关蛋白NADPH氧化酶2（Nox2）、NAPDH（Nox4）氧化酶4和血红素氧化酶-1（HO-1）的表达状况,结果显示,Nox2和Nox4在MI组和CRA治疗组中表达量增加（P<0.05）,具体数值表现为,Nox2增加倍数为（1.18±0.0.45）倍、（0.59±0.22）倍和（0.59±0.30）倍,Nox4增加倍数为（1.3±0.016）倍、（0.68±0.02）倍和（0.45±0.01）倍,HO-1在MI组表达量低于Sham组（0.79±0.14）倍,在CRA治疗组中表达量增加（1.17±0.12）倍和（1.45±0.18）倍（P<0.05）（Figure 3A）,并且呈剂量依赖性（Figure 3B）。实时定量PCR技术检测Nox2、Nox4和HO-1在心脏组织中的转录水平,结果显示Nox2和Nox4在MI组和CRA治疗组中转录水平增加（P<0.05）,与蛋白表达状况相一致,具体表现为Nox2增加倍数为（2.6±0.17）倍、（1.8±0.0.69）倍和（1.89±0.0.19）倍,Nox4增加倍数为（24.06±0.90）倍、（10.70±3.89）倍和（7.58±2.73）倍,HO-1在MI组转录降低（0.67±0.08）倍,在CRA治疗组中转录增加（1.43±0.69）倍和（1.23±0.34）倍（P<0.05）（Figure 3C）。梗死边缘区免疫组化染色显示Nox4在MI组中阳性染色结果增加,在CRA治疗组中阳性染色结果减少,HO-1在MI组中阳性结果减少,在CRA治疗组中阳性染色结果增加（Figure 3D）。Western Blotting检测心肌H9C2细胞中Nox2、Nox4和HO-1在缺氧条件下的表达状况,结果显示Nox2缺氧组中表达量增加（2.14±0.20）倍,在各CRA干预组中表达量分别降低（2.00±0.19）倍、（1.12±0.17）倍和（1.13±0.22）倍,其中5μM和10μM药物浓度组与缺氧组存在统计学差异（P<0.05）;Nox4在缺氧组中表达量增加（1.89±0.08）倍,在CRA药物组中分别降低（1.97±0.10）倍、（1.73±0.05）倍和（1.00±0.07）倍,5μM和10μM药物浓度组与缺氧组存在统计学差异（P<0.05）;HO-1蛋白表达量在缺氧组中增加（2.61±0.33）倍,在各药物组中分别增加（5.02±0.42）倍、（5.07±0.82）倍和（2.56±0.57）倍,其中1μM和5μM相较于缺氧组增加更明显（P<0.05）（Figure 4A）。DCFH活性氧检测结果显示,阳性染色（绿色荧光部分）在缺氧组中增加,在各药物组中减少。Western Blotting检测心肌蛋白细胞表面趋化因子受体2（CCR2）和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）结果显示,MCP-1蛋白表达量在MI组中表达增加（1.56±0.31）倍,在CRA低剂量组治疗组中降低（0.77±0.14）倍,在高剂量组高剂量组中增加（1.44±0.12）倍,其中与MI组相比,低剂量治疗组中蛋白表达水平降低（P<0.05）;CCR2蛋白在MI组中增加（1.47±0.06）倍,在两组药物治疗组中分别降低（0.93±0.20）倍和（0.57±0.04）倍,两组结果与MI组相比明显降低（P<0.05）（Figure 5A）;免疫组化染色显示在梗死区和边缘区MI组阳性结果增加,与MI组相比,在两组药物治疗组中阳性结果减少。TUNEL染色结果显示在MI组阳性结果（绿色荧光）增加,与MI组相比,在各药物治疗组中,阳性结果减少（Figure 6A）;TUNEL染色检测H9C2细胞在缺氧环境中的凋亡状况,结果显示阳性染色（绿色荧光）在缺氧组中增加,与缺氧组相比,各药物干预组中阳性染色结果减少（Figure 6B）;Western Blotting检测H9C2细胞中凋亡相关蛋白Bcl2和C-caspase3的表达状况,结果显示Bcl2在各干预组中表达量增加,具体数值分别为（2.30±0.25）倍、（2.73±0.38）倍、（3.01±0.0.52）倍和（2.29±0.26）倍,5μM治疗组与缺氧组相比存在统计学差异（P<0.05）;C-caspase3蛋白表达水平在缺氧组中增加（1.31±0.19）倍,在个药物组中分别降低（0.84±0.07）倍、（0.48±0.12）倍和（0.42±0.11）倍,与缺氧组相比存在统计学差异（P<0.05）（Figure 6C）。结论:CRA预处理可以有效抑制心肌梗死后纤维化的发展,改善心功能。本研究证明CRA通过激活HO-1抑制Nox2和Nox4氧化应激通路,凋亡减少巨噬细胞浸润和细胞凋亡,从而发挥抑制梗死后纤维化保护心功能的作用。