一株高产漆酶灵芝菌的选育、发酵条件及酶学性质研究

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本文对高产漆酶灵芝(Ganoderma lucidum)菌株的分离筛选、原生质体诱变育种、突变株发酵条件优化、漆酶的分离纯化及酶学性质等进行了较为系统的研究,为利用灵芝生产漆酶打下一定的基础。 对从自然界采集的11个样本和购买的7株白腐担子菌进行产漆酶能力检测,从中筛选到1株高产漆酶菌株—灵芝JR(G. Lucidum JR),培养8d酶活达97.01U/mL。 以灵芝JR为出发菌株,制备原生质体并进行紫外诱变。原生质体制备和再生的最佳条件是:用0.6mol/L的蔗糖作为稳渗剂,4﹪(w/v)的溶壁酶与2﹪(w/v)的蜗牛酶等体积混合,酶解生长48h的菌丝,酶解温度30℃,pH6.0,酶解1h。用愈创木酚作为初筛试剂,紫外照射后的再生菌落与出发菌株比较,筛选到21株酶活较高的突变株。经过液体发酵,筛选到1株酶活较高、发酵时间较短的突变株JR3010,它是用30W的紫外灯距离40cm照射30s得到的,其酶活达185.08U/mL,比出发菌酶活提高了1.91倍;发酵时间为5d,缩短了3d。 研究突变株JR3010的生长及产酶条件,获得酶活最大的培养基组成是:葡萄糖25g/L,大豆蛋白粉10g/L ,KH2PO4 3g/L,MgSO4?7H2O 1.5g/L,VB10.01g/L,最佳初始pH5.0,培养温度28℃,装液量60mL/250mL三角瓶,培养5d酶活达到439.39U/mL,比培养基优化前提高了2.37倍。通过研究金属离子、表面活性剂和底物类似物对菌株产漆酶的影响,发现低浓度的Cu2+、Mn2+、Fe2+对其分泌漆酶有促进作用,浓度高时不仅抑制漆酶分泌,而且抑制菌丝生长;十二烷基磺酸钠(SDS)抑制菌丝生长和漆酶分泌,吐温80对酶的分泌有促进作用;愈创木酚、没食子酸和木质素在低浓度时都能促进漆酶分泌。 通过诱变和培养基优化使灵芝JR漆酶活力共提高4.53倍,发酵周期缩短了3d。 电泳分析发现,JR3010在优化的培养基中培养只分泌一种漆酶。发酵液经透析浓缩、DEAE-纤维素柱层析,比活力提高24.28倍,酶活回收率是18.66﹪。以愈创木酚为底物酶的Km= 1.94×10-4mol·L-1,Vmax=2.28×10-6mol·L-1·min-1;愈创木酚浓度高时对酶活有抑制作用。K+对酶有激活作用,Cu2+激活作用不大,Fe2+、Co2+、Ca2+、Na+、Ba2+对酶活力有抑制作用。
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