论文部分内容阅读
目的环境化学物种类繁多,机体往往同时暴露于多个化学物质,因此,环境化学物混合毒性是人们关注的焦点。邻苯二甲酸二乙基己酯(Di-(2-ethylhcxyl)phthalate,DEHP)和双酚A(Bisphenol A,BPA)是两种常见的环境内分泌干扰物,可对内分泌系统、生殖系统、神经系统及免疫系统等产生不同影响,而且孕期暴露可导致胎儿先天发育异常,降低胎儿的存活率。有研究表明,DEHP和BPA混合暴露具有协同或拮抗作用,但原因未明。两种物质均为内分泌干扰物,具有相似的毒性靶点,那么两种物质呈现的协同或拮抗作用,是否在生物转化环节相互干扰,即一种物质代谢影响另一种物质代谢是我们关心的问题。肝脏是机体重要的代谢解毒器官,也是最容易受到外来化学物损害的脏器,这种损伤是否因母体变化而产生,也是我们关注的问题。因此,本研究建立孕期混合染毒动物模型,利用LC-MS/MS对母鼠血浆代谢轮廓进行分析,通过代谢产物的鉴定,以阐明DEHP及BPA在母体内的代谢路径及二者的关联性;结合子鼠肝脏氧化损伤指标,探讨化学物母体代谢改变与子代损伤的关系,利用生物信息学分析损伤发生的可能信号通路或基因,为化学物混合作用的毒理学机制研究提供参考依据。方法无特定病原体级(SPF)健康SD大鼠(辽宁长生生物技术有限公司,实验动物生产许可证号SCXK(辽)2015-0001)90只,十周龄,其中雄性大鼠30只,雌性大鼠60只。按雌雄比为2:1进行合笼,于次日晨采用阴道涂片法检测,检到精子者记为受孕0天。将受孕的48只雌性大鼠随机分为对照组,BPA组,DEHP组,BPA+DEHP混合染毒组,于受孕第5天至产后21天对母鼠以5ml/kg容积进行灌胃染毒,1次/d,对照组给予等容积玉米油。分别在子鼠出生后第7天、21天、56天每窝随机处理雌、雄子鼠各一只,仔鼠出生21天断乳处死母鼠。观察子鼠肝组织病理学改变,检测氧化损伤指标:丙二醛(MDA)、过氧化氢(H202)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)。对DEHP、BPA及联合染毒孕鼠血浆代谢轮廓进行分析及BPA、DEHP代谢产物的鉴定,利用生物信息学分析手段对DEHP和BPA及其代谢产物与子鼠肝脏氧化损伤的相关性进行评价。结果1、母鼠血中的代谢产物鉴定出BPA、DEHP、MEHP、5oxo-MEHP、50H-MEHP、BPA-GlcA、BPA-OH、GlcA-BPA-OH共8种物质,混合染毒组血浆代谢轮廓与单独染毒组有差异,出现四个不同的色谱峰。2、子鼠出生后第7天时,DEHP组体重高于对照组,BPA组低于对照组;在第21天时,DEHP组子鼠体重高于对照组及BPA组,差异有显著性(P<0.05)。在出生后第7天时,DEHP组的肝脏器系数高于对照组与BPA组;在第21天时BPA组低于对照组,差异具有显著性(P<0.05)。3、光镜下观察肝脏组织病理学变化,对照组肝小叶结构正常,肝细胞排列整齐。在出生后第7天时,DEHP组子鼠肝脏发生肝细胞坏死、脂肪空泡变性,混合染毒组子鼠肝脏出现弥漫性脂肪空泡变性;第21天时,BPA组子鼠肝脏出现弥漫性脂肪空泡变性,DEHP组子鼠肝脏出现弥漫性脂肪空泡变性,尤以小叶中心性严重,门管区周围肝细胞肥大,混合染毒组子鼠肝脏出现重度弥漫性脂肪空泡变性;第56天时,BPA组子鼠肝脏出现小叶中心性肝细胞肥大,肝血窦扩张,DEHP组子鼠肝脏出现脂肪空泡变性,小叶中心性肝细胞肥大,混合染毒组子鼠肝脏出现微小肉芽肿,Kupffer细胞增生,弥漫性脂肪空泡变性以及肝细胞坏死。4、氧化应激指标检测:GSH-Px活力在子鼠出生后第7天时,混合染毒组高于DEHP组、BPA组以及对照组;第21天时,BPA组、DEHP组、BPA+DEHP组高于对照组;第56天时,DEHP组高于对照组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。CAT活性在出生后第7天时,混合染毒组高于对照组、BPA组,低于DEHP组,DEHP组高于对照组、BPA组;第21天时,混合染毒组低于对照组、DEHP组;第56天时,DEHP组高于对照组、BPA组,差异均有统计学意义(P<0.05)。MDA含量在出生后第7天时,BPA组、DEHP组、混合染毒组中MDA含量显著低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。H202含量在出生后第21天时,混合染毒组高于对照组、低于DEHP组,DEHP组高于对照组、BPA组;第56天时,混合染毒组高于对照组、DEHP组,BPA组高于对照组,差异均具有显著性(P<0.05)。SOD活力在出生后第7天时,混合染毒组低于BPA组、DEHP组,混合染毒组、BPA组、DEHP高于对照组;第21天时,混合染毒组、BPA组低于对照组;第56天时,混合染毒组、DEHP组高于对照组,DEHP组高于BPA组,差异均具有显著性(P<0.05)。5、染毒组血浆代谢谱分析检测出5个属于脂肪酸类的差异标志物:棕榈酸、草酸、乙醇酸、乳酸、3-羟基丁酸;并且染毒组中棕榈酸、单棕榈酸甘油酯等脂类代谢产物发生变化。6、对DEHP与BPA及其代谢产物与肝脏损伤的相关性评价,共筛选出11个化学物作用靶点,这些作用靶点显著富集于5-羟色胺能突触信号通路,胰岛素敏感性、胆固醇储存、MAPK级联以及磷脂代谢过程(P<0.05),这些信号通路与化学物所致的肝脏损伤相关。结论一、代谢产物检测发现,DEHP进入机体后,在血中主要以DEHP原型及代谢产物MEHP,5oxo-MEHP,50H-MEHP的形式存在;BPA进入机体后,在血中主要以BPA原型及代谢产物BPA-GlcA,BPA-OH,GlcA-BPA-OH的形式存在。二、孕期DEHP与BPA暴露可以影响子鼠生长发育,使肝组织产生脂肪性空泡样变,肝细胞肿大、坏死等;抗氧化酶CAT及SOD活性降低,过氧化产物H2O2增多,使肝脏产生氧化损伤,并且混合暴露可以使毒效应增强或者减弱。三、BPA及DEHP暴露使母鼠血浆代谢谱发生改变,通过导致机体脂质代谢紊乱,从而对肝脏产生损伤作用,这为毒作用机制探究提供了参考依据。