胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)是具有自我更新和高度分化潜能的细胞，能在体外保持未分化状态无限增殖传代。目前已建立了多种动物和人的ESCs系。昆明系小鼠是我国生物实验中应用最多的实验动物。故本试验以昆明小鼠为实验材料，探讨了小鼠ESCs(mouse ESCs，mESCs)建系的技术方法，为实验室下一步研究水牛ESCs建系提供一套可行的技术理论体系。 本试验包括两部分内容，第一部分为类mESCs分离方法的研究。主要探讨不同胚胎期(扩展囊胚和孵化囊胚)和传代方法对分离类mESCs效率的影响。第二部分为类mESCs鉴定的研究。包括碱性磷酸酶(AKP)染色、RT-PCR分析Oct4和Sox2表达、核型分析和分化能力鉴定。其中检测类mESCs分化能力又通过自发分化和bFGF诱导分化两方面进行。 结果显示：1)扩展囊胚分离类mESCs效率高于孵化囊胚(P<0.05)。虽然在贴壁率和原代克隆形成率二者没有显著差异(P>0.05)，但在孵化囊胚组未获得类mESCs；2)从类mESCs生长形态和AKP染色上看，5代后类mESCs传代使用机械法或Trypsin/EDTA消化法，对维持类mESCs未分化状态没有差异，说明无论机械法还是Trypsin/EDTA消化法都适合对类mESCs进行传代；3)本实验获得的类mESCs传至25代未见形态上的分化，AKP染色呈强阳性，RT-PCR分析显示表达Oct4和Sox2，核型分析显示为正常核型40XY，正常核型率为70％，说明本试验分离的类mESCs具有ESCs的基本特征；4)类mESCs在去除饲养层和LIF、bFGF之后，经悬浮培养形成类胚体(EB)，EB贴壁后在无LIF、bFGF下自发分化为多种类型细胞； 在无LIF、血清以及含20 ng/mL bFGF下诱导分化成神经细胞；AKP染色显示，这两种方式分化的细胞均呈阴性；用Nestin检测诱导分化，呈阳性。说明类mESCs具有体外分化潜能。 综上所述，本试验成功分离出类mESCs，而且所分离的类mESCs符合ESCs的一般特征。这为本实验室下一步研究水牛ESCs建系打下了基础。