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多西他赛(Docetaxel, DTX),半合成紫杉醇类似物,是临床上广泛应用于乳腺癌、胰腺癌、晚期卵巢癌、、非小细胞肺癌等恶性肿瘤治疗的一线药物；通过加强微管蛋白聚集,使得细胞有丝分裂停留于G2/M期而凋亡；多西他赛,脂溶性大于水溶性,水中溶解量较低、体内非特异性分布等特点,临床应用中出现生物利用度比较低现象,明显削弱药物的临床抗肿瘤作用。临床中采用制剂为“多帕菲(?)”和“泰索帝(?)”注射液,处方中均含有大量Tween-80和乙醇用以增溶,其中辅料Tween-80易引起超敏反应、神经毒性、肾毒性等严重副反应。因此,设计和制备高靶向性新型药物传输体系,是目前亟待攻克的难题。脂质体具有良好相容性、缓控释及靶向性、长循环等优点,是最具潜力的新型药物、蛋白、基因等的递送系统之一；脂质体制备过程中加入pH敏感材料亚油酸(LA),进入肿瘤酸性微环境后,脂质双层膜不稳定破裂,迅速释放内容物；精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽序列简写RGD,与整合素有较强特异性亲和力,尤其是αvβ3,近几年作为一种靶向因子得到广泛关注。本文首次合成RGD-PEG-LA,通过PEG链段的“架桥作用”将靶向因子RGD修饰在制剂表面；成功制备RGD介导的载多西他赛pH敏感脂质体(RGD/DTX-PSL),并考察其药剂学和生物学特性,研讨其抗肿瘤治疗的应用前景。本文主要研究内容如下：1 DTX-PSL的制备及理化性质考察本部分建立了HPLC法精确测定DTX体外含量。采用经典薄膜分散法制备,磷脂酰乙醇胺(PE)、胆固醇(CHOL)为主体组成物质,LA为pH敏感物质,包载模型药物DTX；主要考察制剂包封率高低,通过单因素实验和正交优化实验,获得DTX-PSL的最适宜处方组成和成熟制备工艺。同时对DTX-PSL制剂理化性质进行考察,包括平均粒径和粒径分布、Zeta电势、透射电镜(TEM)、载药量(DL%)和包封率(EE%)等指标的测定。测得DTX-PSL制剂的DL%为4.8±0.1%,EE%为81.9±2.2%；动态光散射法测得平均粒径及粒径分布为127.2±3.58 nm, PDI为0.218±0.15, Zeta电势为-35.19±1.27mV；TEM照片可观察制剂外观：圆形或类圆形,均一,表面完整光滑。2 RGD-PEG-LA分子的合成及RGD/DTX-PSL的制备采用固相合成法(FMOC-SPSS),按次序加入芴甲氧羰基N端占位修饰的分子,最终制备得到RGD-PEG-LA分子,并通过电喷雾质谱和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱对结构进行鉴定；DTX-PSL最优处方中加入适量RGD-PEG-LA分子,薄膜分散法制得RGD/DTX-PSL,同样方法考察制剂平均粒径、Zeta电势、透射电镜照片,并表征DL%和EE%等；采用透析袋法,以多帕菲⑧为对照组,分别考察DTX-PSL和RGD/DTX-PSL在pH5.0、pH7.4含0.5% Tween-80磷酸盐释放介质中的释放行为。ESI-MS中最高峰M=347.1是RGD分子离子峰,说明RGD合成正确无误；分析RGD-PEG-NH2和RGD-PEG-LA分子MALDI-TOF-MS图谱,显示在理论分子量2383Da和2645Da处峰位较高,说明已获得目标分子RGD-PEG-LA。测得RGD/DTX-PSL制剂的DL%为4.3±0.2%,EE%为78.4+1.7%；动态光散射法测得平均粒径及粒径分布为146.4±4.38 nm, PDI为0.169±0.13, Zeta电势为-31.82±0.92mV；透射电镜照片中制剂成型完整,均匀如一。体外释放结果可知,与多帕菲(?)对照组相比,DTX-PSL和RGD/DTX-PSL制剂释放时间明显延长,具有较好缓释性；另外,DTX-PSL和RGD/DTX-PSL在pH5.0释放介质中较pH7.4介质释放速度快,且有明显突释现象,显示制剂具有一定pH敏感性；DTX-PSL和RGD/DTX-PSL制剂在不同pH环境中释放趋势相同,可知RGD靶向因子的存在并没改变脂质体的体外释放特性。3 DTX-PSL和RGD/DTX-PSL的体内、外抗肿瘤实验采用MTT法研究Duopafei(?), DTX-PSL、RGD/DTX-PSL制剂对人乳腺癌MCF-7细胞的毒性作用；载香豆素-6脂质体(C6-PSL和RGD/C6-PSL)与MCF-7孵育后,倒置荧光显微镜定性查看荧光强度并拍照,流式细胞仪定量测定荧光摄取情况。荷瘤Balb/c-Nu尾静脉注射NBD-PSL、RGD/NBD-PSL制剂,共聚焦显微镜观察肿瘤切片中荧光强度；抑瘤率实验中测定鼠体重、肿瘤体积、剥离瘤块重量,考察制剂体内抗肿瘤活性。MTT实验中Duopafei(?)、DTX-PSL、RGD/DTX-PSL制剂与MCF-7作用不同时间,能杀死一半细胞的药物浓度(IC50)分别为24 h：6.81+0.53、4.43+0.15、2.44+0.49,48 h：5.06+0.33、2.47q0.20、1.28±0.23,72 h：1.84±0.10、1.50±0.13、1.05+0.04。细胞摄取和肿瘤切片实验显示：两制剂组荧光强度远高于游离荧光材料组,且RGD/DTX-PSL组荧光强度高于未修饰脂质体组。抑瘤率实验中瘤体积大小为：生理盐水组>Duopafei(?)>DTX-PSL>RGD/DTX-PSL。以上结果,说明本实验制备的靶向脂质体体内、外抗肿瘤效果良好。4 DTX-PSL和RGD/DTX-PSL大鼠体内药动学研究本实验以SD大鼠为实验动物,分别尾静脉注射Duopafei(?)、 DTX-PSL RGD/DTX-PSL制剂,按预设时间点颈静脉窦取血,液液萃取法处理血样,加入紫杉醇作为内标物,HPLC法测定血液中药物浓度,并利用DAS2.0处理得统计矩参数。DTX-PSL、 RGD/DTX-PSL制剂AUCo-∞(25.363,38.081)值均大于Duopafei(?)组AUC0-∝值(10.703),而CLz值(0.513,0.341)远小于Duopafei(?)组CLz(1.215),说明在相同时间点DTX-PSL、RGD/DTX-PSL组大鼠体内药浓度均高于Duopafei(?)组。另外,DTX-PSL、RGD/DTX-PSL制剂t1/2z(2.455,3.478)分别为Duopafei(?)组t1/2z(1.187)的2倍、3倍,可知DTX-PSL、RGD/DTX-PSL制剂能够明显延长药物在血液中的存留时间。综上所述,本文通过合成RGD-PEG-LA分子,将RGD分子修饰于pH敏感脂质体表面,制备工艺简单,粒径均匀,外观良好,极大提高多西他赛溶解度；通过pH敏感物理化学靶向及RGD主动靶向的联合作用,促使载药制剂准确的输送至肿瘤部位,减少正常组织中药物分布,大大减少多西他赛毒性,增强抗肿瘤疗效,为进一步发展安全、稳定、高效的药物运输体系提出了新思路。本论文由国家自然科学基金(No.21203112)支持完成。