球虫病是集约化家禽养殖业最为高发、风险严重且防治工作艰巨的疾病之一,全世界每年因球虫病造成的亏损和防治费用高达20亿英镑。当前,控制球虫病的主要方式是使用抗球虫药物和活疫苗,但球虫耐药性的产生、药物残留和活疫苗潜在散毒等问题的产生,推动我们迫切地寻求新的防治途径来控制球虫病。子孢子是球虫从体外侵入宿主细胞发生感染的第一个阶段。阻断子孢子侵入宿主细胞,是防治球虫病的一种行之有效的方式。顶膜抗原1(AMA1)是顶复器门原虫中一种高度保守的微线蛋白,在疟原虫、弓形虫等裂殖子/速殖子入侵宿主过程中,AMA1能与多个棒状体颈部蛋白(RON2/4/5/8)相互作用,形成复合物,在虫体侵入宿主细胞过程中发挥重要的功能。在前期研究中,我们发现柔嫩艾美耳球虫AMA1(Eimeria tenella AMA1,Et AMA1)在子孢子中蛋白表达水平要明显高于未孢子化卵囊、孢子化卵囊和裂殖子阶段,其抗体能明显抑制子孢子入侵,表明Et AMA1是子孢子入侵宿主的关键蛋白,但机制尚不清楚。本研究旨在利用GST pull-down联合质谱技术,筛选出与Et AMA1发生相互作用的子孢子蛋白,并对其中的两个潜在作用蛋白的特性进行了研究,研究结果为阐明球虫子孢子入侵宿主细胞的分子机制奠定基础。1.柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原-1潜在子孢子互作蛋白的筛选为了筛选与柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原-1(Et AMA1)存在互作的子孢子蛋白,对已构建好的原核表达质p GEX-6P-1-Et AMA1进行重组蛋白的表达与纯化,纯化的重组蛋白Et AMA1-GST经Western blot验证,结果显示在约72 k Da处有单一的目的条带,证实了所获得的蛋白为Et AMA1-GST融合蛋白。将Et AMA1-GST蛋白、GST蛋白和PBS分别与谷胱甘肽琼脂糖珠孵育后,再分别与子孢子裂解物共孵育,洗脱液经SDS-PAGE分析后,结果显示三者之间的条带明显不同,将差异条带切下进行质谱分析,对获得的蛋白质肽段与Uniprot中鸡球虫蛋白质数据库进行blast比对,初步获得了10个与Et AMA1存在潜在互作的柔嫩艾美耳球虫子孢子蛋白,包括微线体蛋白、糖酵解酶类、肌动蛋白相关因子以及一些保守蛋白等,广泛参与了虫体的入侵、发育、能量代谢等生物学过程。研究结果为进一步阐明Et AMA1在球虫入侵宿主细胞中发挥重要作用的分子机制奠定基础。2.柔嫩艾美耳球虫0440和MIC2蛋白与AMA1蛋白互作关系的验证从获得的10个与Et AMA1潜在互作的子孢子蛋白中,选取柔嫩艾美耳球虫微线体蛋白2(Microneme protein 2,Et MIC2)和假想蛋白0440(Et0440)进行进一步试验。以柔嫩艾美耳球虫子孢子c DNA为模板,通过PCR扩增获得Et MIC2和Et0440基因的开放阅读框,其中,Et MIC2基因的部分ORF为1029bp,编码342个氨基酸,编码蛋白理论分子量为38k Da;Et0440基因的开放阅读框大小为423bp,编码140个氨基酸,编码蛋白理论分子量为15.5k Da。构建pc DNA3.1(+)-flag-Et0440、pc DNA3.1(+)-flag-Et MIC2、p Bi FC-VN155-Et0440和p Bi FC-VN155-Et MIC2真核表达质粒,并将其转染至DF-1细胞,经Western Blot和间接免疫荧光鉴定真核质粒均表达后,通过免疫共沉淀(Co-IP)和双分子荧光互补(Bi FC)技术对蛋白是否与Et AMA1存在相互作用进行验证。Co-IP结果显示,两实验组均无蛋白复合物的形成,只出现Et AMA1的特异性条带,说明Et0440与Et AMA1、Et MIC2与Et AMA1不存在相互作用。Bi FC结果显示,阳性对照组产生绿色荧光,而阴性对照组,p Bi FC-VN155-Et0440和p Bi FC-VC155-Et AMA,p Bi FC-VN155-Et MIC2和p Bi FC-VC155-Et AMA1无绿色荧光,说明Et0440与Et AMA1、Et MIC2与Et AMA1不存在相互作用。3.柔嫩艾美耳球虫Et0440和Et MIC2基因的原核表达及其功能的初步研究将Et0440和Et MIC2基因片段分别连接到原核表达载体p ET32a和p ET30a上,转化至大肠杆菌BL21中,在37℃条件下加入IPTG成功诱导表达重组蛋白His-Et0440和His-Et MIC2。将重组蛋白纯化后免疫新西兰大白兔制备多抗血清,Western blot结果显示Et0440和Et MIC2均具有良好的免疫原性和反应原性。利用间接免疫荧光技术结果显示,Et0440主要分布于经细胞培养基孵育后子孢子的前端和第二代裂殖子的顶端,第一代裂殖子的两端;而Et MIC2主要分布在子孢子和第二代裂殖子的前端,第一代裂殖子的两端。纯化重组蛋白His-Et0440和His-Et MIC2制备的多抗进行体外抑制实验,结果显示与兔Ig G处理子孢子对照组相比,anti-Et0440在浓度为400μg/m L时,抑制率达到40%以上,可以明显的抑制虫体入侵细胞;与兔Ig G处理子孢子对照组相比,anti-Et MIC2在浓度为400μg/m L时,抑制率达到20%,存在抑制作用,但是与Et0440相比要低,因此初步推测Et0440和Et MIC2可能与虫体入侵宿主细胞相关。4.柔嫩艾美耳球虫Et0440和Et MIC2真核表达质粒免疫保护效能评价7日龄雏鸡进行称重随机分为八组,使各组的平均初重基本相同。分别肌肉注射100μg/羽和200μg/羽的真核重组表达质粒pc DNA3.1(+)-flag-Et0440、pc DNA3.1(+)-flag-Et MIC2及空质粒pc DNA3.1(+)-flag,同时设置感染对照组和健康对照组,一免七天后进行二免,在二免七日后经口服接种1万/羽柔嫩艾美耳球虫上海株孢子化卵囊,通过对体重、盲肠病变记分、卵囊排出量等指标检测的检测来评价免疫效果。实验结果显示,免疫期间,实验组、感染对照组和健康对照组增重差异不显著(P>0.05)。在攻虫后9天,免疫组增重普遍高于感染对照组增重,其中pc DNA3.1-flag-0440(200μg/羽)组增重明显高于感染对照组(P<0.05),说明柔嫩艾美耳球虫对鸡的生长发育具有明显的抑制作用,而重组质粒对于抵抗球虫感染具有一定的作用;各实验组卵囊减少率均在65%以上,明显高于感染对照组和空载体对照组。同时我们检测了细胞因子的水平,结果显示,二免后7天实验组IFN-γ和攻虫后实验组IL-17均明显高于对照组(P<0.05),而免疫后和攻虫后TGF-β的变化均不显著(P>0.05)。以上结果表明,重组质粒pc DNA3.1(+)-flag-Et0440和pc DNA3.1(+)-flag-Et MIC2对感染柔嫩艾美耳球虫鸡具有一定的保护效果。