咖啡碱作为茶树中的重要次生代谢产物,能刺激人体神经缓解疲劳,其含量高低与茶叶品质密切相关。因此,揭示茶树中咖啡碱合成的调控机制有利于茶叶品质的提升。已有的研究表明,在茶树咖啡碱生物合成中最重要的酶类是咖啡碱合酶TCS,但对其调控机制和表达模式研究尚不清晰。为了揭示TCS基因被转录因子调控的表达模式和其调控咖啡碱的合成机制,本研究以福鼎大白茶树品种为材料,克隆TCS基因启动子序列,构建诱饵载体菌株,利用酵母单杂交技术筛选出调控TCS基因的候选转录因子,以此来揭示转录因子调控TCS基因的表达模式。实验结果如下:1.TCS基因启动子序列克隆和分析根据茶树基因组数据,通过PCR扩增实验获得茶树TEA022575、TEA024636基因的启动子序列。通过Plantcare和Soft Berry分析实验获得的TEA022575、TEA024636基因的启动子序列,分析其顺式作用元件和转录起始位置,发现其不仅包含了ABRE、ERE等植物激素响应元件,还包含了光响应元件G-Box、GT1-motif以及环境响应元件MYB、MYC等。2.TCS基因在茶树不同部位的表达分析通过q-PCR对茶树不同组织中TCS基因分析,结果表明TEA022575基因在花中的表达量最高,其次是茎;TEA024636基因在根和芽中的表达量相对较高,而在其他部位几乎不表达。且构建GFP载体遗传转化烟草验证后,其植株表达情况与q-PCR的结果相似,说明不同的TCS基因在茶树体内可能存在组织特异性。3.TCS基因对激素的响应分析激素处理福鼎大白茶树,q-PCR实验结果表明,TCS的表达对ABA,GA3,乙烯利和茉莉酸甲酯均具有响应作用。其中TEA022575基因对赤霉素和茉莉酸甲酯的响应明显;而TEA024636基因对多脱落酸和茉莉酸甲酯的响应程度较低,说明不同的TCS基因在茶树体内对激素变化的响应模式存在差异。4.调控TCS基因表达转录因子的筛选通过TCS基因启动子p HIS2-575和p HIS2-636诱饵表达载体构建,转化Y187酵母菌株,成功获得诱饵菌株。利用酵母单杂交试验筛从TEA022575、TEA02463各筛选得到9和12个阳性克隆,检测阳性克隆得到生长素抑制蛋白ARP和一个茶树未知蛋白,对其进行了下一步研究。