【摘 要】
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禽白血病（Avian leukosis,AL）是由禽白血病病毒（Avian leukosis virus,ALV）引起禽类的某些细胞恶性增生的肿瘤性疾病的统称。近几年,AL宿主范围有不断扩大趋势,从最初的白羽肉鸡扩散到蛋鸡和地方品系鸡,甚至还感染野生鸟类、水禽等。国内对珍禽感染禽白血病的相关报道很少;广东省历来有规模化养殖珍禽的传统,但未进行过珍禽禽白血病病毒感染情况的系统性调查。本研究拟对广东省
【基金项目】
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国家重点研发计划（2016YFD0501606）； 广东省家禽产业技术体系疾病控制岗位专家（2018LM1114）； 国家肉鸡产业技术体系岗位科学家（CARS-41-G16）；
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禽白血病（Avian leukosis,AL）是由禽白血病病毒（Avian leukosis virus,ALV）引起禽类的某些细胞恶性增生的肿瘤性疾病的统称。近几年,AL宿主范围有不断扩大趋势,从最初的白羽肉鸡扩散到蛋鸡和地方品系鸡,甚至还感染野生鸟类、水禽等。国内对珍禽感染禽白血病的相关报道很少;广东省历来有规模化养殖珍禽的传统,但未进行过珍禽禽白血病病毒感染情况的系统性调查。本研究拟对广东省内的规模化七彩山鸡种禽场和鹌鹑场开展ALV病原学调查,从而为制定适合规模化珍禽场禽白血病等蛋传递性疾病的防控措施提供依据。本研究通过病毒分离、ELISA、PCR、囊膜基因测序等方法对3个规模化的七彩山鸡种禽场和1个鹌鹑场进行ALV病原学调查。从广东的A、B、C 3个七彩山鸡种禽场分别采集60、126、50份的血浆样品和D场采集30份鹌鹑血浆样品,进行基于CEF和DF-1细胞的病毒分离。经ALV-p27 ELISA检测结果表明,接种于DF-1细胞的ALV阳性率分别为:1.6%（1/60）、6.3%（8/126）、4%（2/50）、0%（0/30）;接种于CEF细胞的检测阳性率分别为:5%（3/60）、4%（5/126）、4%（2/50）、0%（0/30）;PCR扩增和囊膜基因测序结果表明,从266份血浆样品中分离到4株ALV-F、4株ALV-J和3株ALV-E,将其名为FGD1801～FGD1804、JGD1801～JGD1804及EGD1801～EGD1803。这是首次从华南地区七彩山鸡中发现ALV-F的存在。为了解11个七彩山鸡源ALV分离株的遗传进化特点。通过囊膜基因测序和利用Megalign软件对各分离株gp85基因序列进行相似性和遗传进化分析。结果表明ALV-F分离株FGD1801、FGD1802、FGD1803、FGD1804的gp85基因核苷酸序列之间的相似性为90.6%～96.2%,与ALV-F参考毒株的相似性为91.5%～99.3%,且在同一进化分支上,而与其他各亚群的相似性为45.9%～64.9%;ALV-E各分离株EGD1801、EGD1802、EGD1803的gp85基因核苷酸序列的相似性为99.6%～99.9%,与ALV-E参考毒株的相似性为98.8%～99.9%,与ALV-A、B、C、D、K参考毒株的相似性为85.4%～88.0%,与ALV-F参考毒株的相似性为63.8%,与ALV-J的相似性最低为48.4%～50.2%;ALV-J分离株JGD1801、JGD1802、JGD1803、JGD1804的gp85基因核苷酸序列的相似性为99.5%～100%,与ALV-J参考毒株的相似性为87.6%～97.6%,与国内外ALV-A、B、C、D、E、F、K参考毒株的相似性为48.0%～50.8%。为了更好地了解新发现F亚群ALV基因组结构特点,通过分片段PCR扩增方法获得ALV-F FGD1803分离株全基因组序列。序列分析结果表明:FGD1803全长为7459bp,符合反转录病毒的基因结构特征;FGD1803与ALV-A、B、C、D、E、J、K参考毒株相应基因组gag基因、pol基因、R、U5序列的相似性较高为71.4%～100%,而env基因及U3区域相似性较低,分别为53.1%～67.1%、25.5%～38.0%。这是国内首次报道的ALV-F全基因组序列。为了建立针对新发现ALV-F的快速检测方法,依据分离株ALV-F env基因的序列,分别设计常规PCR和荧光定量PCR引物,对常规PCR方法的特异性和荧光定量PCR方法的灵敏性、特异性和稳定性进行评价。结果表明,常规PCR特异性好;荧光定量PCR方法特异性强,与其他病毒交叉反应;荧光定量PCR方法敏感性为1.16×102拷贝/μL;荧光定量PCR批内和批间重复性试验的变异系数均小于5%。对临床样品检测表明,荧光定量PCR检出的阳性率为33.3%（10/30）,常规PCR方法检出的阳性率为20.0%（6/30）。综上所述,本研究首次对广东的规模化珍禽场进行了ALV病原学调查,结果显示这些规模化七彩山鸡种禽场已经受到ALV-J为代表的外源性ALV感染,其潜在的危害需要引起足够的重视;本论文首次还从广东的七彩山鸡中分离到ALV-F,并获得了1株七彩山鸡ALV-F全基因组序列,率先建立了特异性的ALV-F常规PCR和荧光定量PCR方法。
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