论文部分内容阅读
矿物风化作用是在地球表面发生的最重要的地质过程之一,是各种地貌形态和土壤形成的基础。硅酸盐矿物风化在陆地生态系统中扮演着重要的作用。目前,已分离到的具有硅酸盐矿物风化能力的细菌资源非常丰富,但对这些细菌风化矿物的分子作用机制研究极其薄弱,尤其是细菌群体感应系统在硅酸盐矿物风化过程中的作用机制还尚未见报道。因此,本文从本课题组保藏的矿物风化细菌中筛选具有群体感应系统（以产酰基高丝氨酸内酯类信号分子为筛选条件）的高效矿物风化细菌,研究菌株的群体感应系统在风化硅酸盐矿物中的作用机制,以期为细菌风化硅酸盐矿物的机制提供理论依据和试验基础。从本课题组保藏的18株矿物风化细菌中筛选到一株具有群体感应作用的高效矿物风化细菌Rhizobium pusense S41,通过全基因组测序分析,基因敲除与回补,转录组测序分析等多种分子生物学手段研究了菌株S41中一套群体感应系统TraI-TraR对其风化黑云母的作用效应和机制,并明确受该系统调控的下游关键基因在菌株S41风化黑云母过程中的重要影响。选择本课题组保藏的18株革兰氏阴性细菌M306,F103,R22,R24,G42,g27,F22,1112,A1121,S41,H66,1037,2105,2034,5112,M78,M109 和 Z29。对供试菌株进行AHLs（酰基高丝氨酸内酯Acyl-homoserine lactones）含量、矿物风化效果和抗生素抗性检测,发现有10菌株能合成自体诱导物AHLs;同时有4株菌对黑云母和钾长石的风化效果较好;但只有一株菌对高浓度的庆大霉素和卡那霉素表现敏感。因此,选择菌株Rhizobium pusense S41作为后续试验的供试菌株。研究菌株S41在贫营养（BHm）培养基中风化黑云母的效果,发现菌株S41释放的Si、Al、Fe比不接菌的对照增加了 3.3-57倍。另外,菌株S41在发酵液中的多糖含量和在黑云母表面吸附的细胞数量分别为1.3 mg mL-1和108 cfu mL-1。对菌株Rhizobiumpusense S41进行全基因组测序,发现其基因组含有一条环状染色体（2.95 Mb）和一条线型染色体（2.57 Mb）,且具有许多与细菌吸附、多糖合成等直接相关的基因（簇）。同时,在线型染色体上鉴定到两个属于群体感应系统的关键基因traI和traR（与模式菌株中的同源基因最高相似度为73%和77%）。采用同源重组的方法构建了单突变株S41ΔtraI和S41ΔtraR发现其合成AHL的活性值比野生株降低了 90-92%;采用TLC和UPLC-MS分析菌株S41合成的AHL种类,发现菌株S41 至少可以合成 6 种不同结构的 AHL（C4-HSL,3-Oxo-C6-HSL,3-Oxo-C8-HSL,C8-HSL,3-Oxo-C10-HSL 和 3-OH-C10-HSL）,其中 3-Oxo-C8-HSL 所占比例最高,而突变株S41ΔtraI和S41ΔtraR仅能合成少量的3-Oxo-C8-HSL。比较突变株和野生株对黑云母的风化效应,发现突变株S41 ΔtraI和S41 ΔtraR在风化黑云母过程中溶出结构元素Si、Al、Fe的量比野生株减少12-68%。同时,与野生株相比,突变株S41ΔtraI和S41ΔtraR合成的生物膜、胞外多糖及在矿物表面吸附的细胞数量降低了 12-75%。对突变株S41ΔtraI和S41ΔtraR进行基因回补,发现回补株合成AHLs的能力、释放黑云母中Si、Al、Fe的含量等与野生株相比无显著差异。通过qRT-PCR技术,分析菌株S41,S41-pBB2,S41ΔtraIH和S41ΔtraRH中基因traI和traR分别在添加和未添加黑云母的BHm培养条件下的相对表达量,发现基因traI和traR在添加黑云母的BHm培养基中表达量上调（logFC≥1.5且P≤0.05）了 1.7-4.9倍。构建双突变株S41ΔtraIΔtraR,发现突变株对黑云母中Si、Al、Fe的释放量与野生株相比显著降低26-70%。采用转录组测序技术比较野生株和双突变株S41ΔtraIΔtraR在风化黑云母过程中的基因表达差异。结果表明,在静置培养2h时,突变株（Mt）相比野生株（WT）,有47个基因上调（logFC≥2且P≤0.05）,106个基因下调（logFC≤-2且P≤0.05）;在培养9 h时,仅有35个基因上调,62个基因下调。通过对这些下调基因进行基因注释和KEGG通路富集分析,发现菌株S41中多个与铁离子转运、糖运输、菌毛合成和水解ATP有关的基因表达发生下调,下调程度最显著的8个基因属于细菌Ⅳ型分泌系统。其中3个是编码ATP水解酶的基因virB4（下调6.2倍）、virB11（下调4.9倍）和virD4（下调4.4倍）,3个编码菌毛蛋白的基因virB2（下调6.3倍）、virB3（下调15倍）和virB5（下调5.5倍）,1个编码内膜通道蛋白的基因virB10（下调5.4倍）和1个编码外膜通道蛋白的基因virB9（下调 6.0 倍）。利用同源重组技术将菌株S41基因组中位置相邻的基因virB2、virB3和virB4同时敲除,构建突变株S41ΔvirB234。与野生株相比,突变株的蹭动性减弱,生物膜合成显著减少（71%）;此外,突变株S41AvirB234在风化黑云母过程中溶出Si、Al、Fe的量和在矿物表面吸附的细胞数量显著降低12-75%。对突变株S41ΔvirB234进行缺失基因回补,发现回补株合成生物膜能力和风化黑云母过程中溶出的Si、Al、Fe等与野生株相比无显著差异。通过qRT-PCR技术,分析菌株S41与回补株S41-pBB2和S41AvirB234H中基因virB2、virB3和virB4分别在添加和未添加黑云母的培养条件下的相对表达量,发现基因virB2、virB3和virB4在添加黑云母的培养基中表达量上调（logFC ≥ 1.5 且 P ≤ 0.05）了 3.4-21 倍。另外,对一株具有硅酸盐矿物风化能力的菌株Chitinophaga sp.Z29进行了生理生化特征分析及分子遗传学鉴定,结果表明菌株Z29与同属的Chitinophaga polysaccharea MRP-15T,Chitinophaga arvensicola M64T 等 5 株菌具有较高的同源性,同源性在96-98.2%;菌株Z29的主要脂肪酸成分为iso-C15:0,C16:1ω5c和iso-C17:0 3-OH;主要极性脂为磷脂酰乙醇胺（PE）,呼吸醌为MK-7,主要产多胺类型为高精脒;DNA G+C mol%含量为51.3%;与参比菌株的DNA-DNA的杂交同源性为14.6-29.8%。由此可确定菌株Z29为Chitinophaga属的一个新种,并将其命名为Chitinophaga longshanensis sp.nov.。