年轻恒牙的根尖周病多由牙髓炎症或牙髓坏死发展而来,此时的牙髓感染可通过宽阔的根尖孔引起根尖周组织的炎症或病变。由于年轻恒牙牙髓和根尖周组织疏松,血液丰富,一旦发生炎症,感染易于扩散,如治疗及时,炎症也易控制和修复。根尖诱导成形术（Apexification）和根尖屏障术（Apical barriers）用于诱导或者人为形成根尖屏障,达到根尖闭合的目的。牙髓再生治疗通过诱导内源性或外源性导入根管内的干细胞分化,再生功能性牙髓组织,促进牙本质、牙髓-牙本质复合体及牙根等继续发育。人牙髓干细胞（Human dental pulp stem cells,h DPSCs）是一类间充质干细胞的衍生细胞,由于其较强的增殖能力以及易于获得的特性,被认为是用于牙髓再生治疗的一类理想种子细胞。目前为止,大多数学者对于DPSC的体外培养微环境为21%氧浓度微环境即常氧。然而DPSC在体内所处的微环境为低氧。氧气浓度直接影响细胞增殖能力、多向分化潜能、凋亡水平以及损伤修复等生物学进程。Wnt5a作为非经典WNT信号通路的信号分子,在牙发育各个阶段对细胞增殖、迁移、分化具有调控作用。有体外研究发现Wnt5a调控DPSCs的成骨/成牙分化,但在低氧环境下的研究尚未见报道,因此本研究试探讨体外低氧环境下Wnt5a对h DPSCs成骨/成牙分化能力的调控。目的:通过体外构建3%氧浓度低氧环境及过表达Wnt5a,探究Wnt5a对h DPSCs成骨/成牙分化的影响。方法:1.收集新鲜拔除的人离体牙,从牙髓中提取h DPSCs,流式细胞术鉴定细胞表面抗原,使用茜素红（ARS）染色、油红O染色鉴定h DPSCs的诱导成骨、成脂分化能力。2.使用三气培养箱构建3%氧浓度用于培养人h DPSCs,CCK-8法检测3%氧浓度对h DPSCs增殖能力的影响。腺病毒介导的Wnt5a（Ad-Wnt5a）转染h DPSCs用于过表达Wnt5a。3.实验设置3组:常氧组（21%O2）、低氧组（3%O2）、低氧（3%O2）+Wnt5a组。成骨诱导培养后14和21天进行碱性磷酸酶（ALP）染色和ARS染色,检测碱性磷酸酶和矿化结节形成情况。提取第7天细胞RNA和蛋白,RT-q PCR检测成骨/成牙相关基因Alp,Osx,Ocn,Opn,Col 1,Runx2,Dmp1,Dspp的m RNA表达。Western Blot检测RUNX2,DMP1,DSPP的蛋白表达。结果:1.分离培养的细胞形态呈梭形,集落式生长。流式细胞术结果显示CD73,CD90,CD146阳性表达,CD31,CD45阴性表达,符合h DPSCs特征。经过成骨诱导21天,ARS染色显示红色钙化结节形成;经过成脂诱导21天,油红O染色显示红色脂滴形成,表明h DPSCs可诱导分化为成骨、成脂细胞,符合间充质干细胞特性。2.CCK-8结果显示,3%氧浓度对h DPSCs的增殖能力无明显影响。Ad-Wnt5a、Ad-GFP转染h DPSCs后,镜下可见绿色荧光表达。24 h RT-q PCR和Western blot结果显示低氧组HIF1-α表达升高、转染Wnt5a组有一定程度降低（P＜0.05）;低氧组Wnt5a表达降低、转染Wnt5a组表达显著升高,说明Wnt5a过表达成功。3.ALP和ARS染色结果显示3%氧浓度微环境对h DPSCs碱性磷酸酶和钙化结节形成有抑制作用,转染Wnt5a后,这种抑制作用被部分抵消,证明Wnt5a在低氧环境下可以保护h DPSCs的成骨分化活性。4.第7天RT-q PCR结果显示低氧组Alp,Osx,Col 1,Opn,Ocn,Runx2,Dmp1,Dspp的m RNA表达较常氧组降低（P＜0.05）,表明3%氧浓度下h DPSCs成骨/成牙基因表达下降;在过表达Wnt5a后,观察到Osx,Col 1,Dspp的m RNA水平显著上升,高于低氧组及常氧组,Alp,Opn,Ocn,Runx2,Dmp1较表达介于常氧组和低氧组之间（P＜0.05）,表明Wnt5a的过表达上调3%氧浓度微环境下h DPSCs成骨/成牙相关基因表达。Western Blot结果显示各组h DPSCs均表达蛋白RUNX2,DMP1和DSPP,低氧组表达最低,过表达Wnt5a组蛋白表达增加,说明Wnt5a保护低氧环境下h DPSCs成骨/成牙相关蛋白表达。结论:体外实验中,3%氧浓度微环境抑制h DPSCs的成骨/成牙分化能力,过表达Wnt5a保护低氧环境下h DPSCs成骨/成牙分化能力,在牙组织工程中具有潜在的应用价值。