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1目的苍术为常用燥湿健脾药,其不同的炮制饮片主治功效各有侧重。生苍术燥湿,祛风,散寒能力强,主要用于湿阻中焦,风湿痹痛,肌肤麻木,脚膝疼痛,风寒感冒等;而焦苍术健脾止泻作用增强,临床主要用于治疗脾虚、湿困脾胃而引起的腹泻。本研究通过对苍术炒焦前后非挥发性提取部位健脾止泻药效的研究,以药效为向导,寻找苍术炒焦后药效改变的变量成分,特别是增量成分,并探讨焦苍术健脾止泻的药理机制,初步阐释焦苍术的炮制原理及其长于“健脾止泻”的主要物质基础和作用机理。2方法与结果2.1苍术炒焦前后各提取部位“健脾止泻”药效研究苍术炒焦前后水提物部分依次用二氯甲烷、水饱和的正丁醇依次萃取,得到二氯甲烷部位、正丁醇部位和萃余水部位,制成各提取部位浸膏。选择脾虚泄泻模型,参苓白术丸为阳性药;以腹泻指数、小肠推进率、胃残留率、血浆MTL、血清GAS、VIP、TNF-α、IL-10和结肠AQP3为考察指标,进行生苍术和焦苍术各提取部位的药效学研究。结果显示,宏观腹泻指数方面,焦品组显著低于相应部位、相同剂量的生品组（P<0.05）,且焦品正丁醇部位高剂量组腹泻指数降低至与阳性药组无统计学差异（P>0.05）;在调节胃肠动力（小肠推进率、胃残留率、血浆MTL、血清GAS、VIP）方面,正丁醇部位>二氯甲烷部位>水部位,且焦品正丁醇部位对胃肠动力的调节功能明显优于生品正丁醇部位（P<0.05）;在炎性因子调节方面,正丁醇部位药效明显优于二氯甲烷部位和水部位,且焦品正丁醇部位对炎症的作用强度明显优于相应剂量生品正丁醇部位（P<0.05）;此外,在结肠AQP3表达方面,焦苍术正丁醇部位高、低剂量组显著优于其他给部位药组,并与正常组和阳性组无显著性差异（P>0.05）。2.2各提取部位对中焦湿邪的影响选择湿阻中焦模型,香砂胃苓丸为阳性药;以肾脏AQP2、血浆ALD和电解质水平为指标,考察生苍术和焦苍术各提取部位对模型动物水盐代谢的影响。结果,模型组大鼠AQP2和ALD显著升高（P<0.01）,表明水湿内停;同时模型大鼠血浆K+浓度较正常组显著降低（P<0.05）,而Na+和Cl-浓度有所升高,但无统计学差异（P>0.05）。经给药处理后,阳性药组、生品正丁醇部位高剂量组大鼠肾脏AQP2和血浆ALD显著降低,且其血浆K+水平升高至与正常组无统计学差异外（P>0.05）;其他给药组药效不显著。2.3苍术炒焦前后非挥发性主要增量成分研究通过镜像对比生苍术和焦苍术正丁醇提取部位的HPLC指纹图谱,发现焦苍术正丁醇部位指纹图谱在3.4、4.5、9.0、15.4、23.6 min分别有5个峰面积显著升高的对应色谱峰,同时5.4、8.6 min产生2个面积较小的新色谱峰。结合苍术文献和课题组前期在麸炒苍术药效成分研究的积累,测定苍术中主要药效成分含量,结果焦苍术中5-羟甲基糠醛、苍术苷A和鞣质的含量显著高于生苍术,增量幅度依次为18倍以上、50%以上和125%以上;且焦苍术吸附力明显增强,增幅达15%以上。2.4焦苍术主要增量成分“健脾止泻”药效研究2.4.1对急性腹泻小鼠腹泻指数的影响模型组小鼠大黄灌胃1 h后陆续出现明显的腹泻症状,且腹泻指数达到0.9以上,而正常组无稀便现象。与模型组相比,各给药组小鼠首次稀便时间延迟,腹泻指数不同程度降低;除5-羟甲基糠醛低剂量组外,各给药组腹泻指数均与模型组有显著性差异（P<0.05）,其中5-羟甲基糠醛高剂量组,苍术苷A高剂量组,鞣质高、低剂量组和联合给药高、低剂量组有极显著差异（P<0.01）。2.4.2对胃肠动力的影响采用大黄灌胃法造模,经给药、取样,ELISA法等检测。结果,模型大鼠小肠推进率、血浆MTL和血清GAS极显著降低（P<0.01）,而胃残留率和血清VIP极显著升高（P<0.01）。给药后,5-羟甲基糠醛、苍术苷A、鞣质和联合给药组均表现出增强胃肠动力作用,其中5-羟甲基糠醛和苍术苷A高剂量组,鞣质和联合低剂量组对胃肠动力的调节作用较显著,且显示三者在促进胃肠动力方面存在一定协同作用;同时,鞣质高剂量组和联合高剂量组对胃肠动力调节作用反而减弱。2.4.3对消化道炎症的影响ELISA检测结果显示,模型组大鼠血清TNF-α极显著升高（P<0.01）,而IL-10水平极显著降低（P<0.01）,并伴随明显的腹泻症状,消化道炎症明显。各给药组TNF-α水平较模型组极显著降低（P<0.01）,IL-10水平显著升高（P<0.05）;其中阳性药组、5-羟甲基糠醛高剂量组和联合高剂量组TNF-α水平与正常组无统计学差异（P>0.05）,且阳性药组、鞣质高剂量组和联合高剂量组IL-10水平极显著升高（P<0.01）。同时,结肠切片HE染色结果显示,阳性药组和5-羟甲基糠醛、苍术苷A、鞣质高剂量组以及联合高剂量组炎症恢复明显,表现为蓝紫色区域减少、固缩细胞聚集区密度显著降低,柱状和杯状细胞分布较规整,绒毛形态清晰,断裂减少。2.4.4对水盐代谢的影响ELISA和生化检测结果显示,模型大鼠结肠AQP3极显著降低（P<0.01）,肾脏AQP2显著升高（P<0.05）,同时血浆ALD极显著升高（P<0.01）,但血浆电解质水平与正常组不存在统计学差异。在对水通道蛋白调节方面,除5-羟甲基糠醛低剂量外,其他给药组结肠AQP3的表达水平均显著高于模型组（P<0.05）;单独给药对肾脏AQP2影响不显著,只有联合高剂量组肾脏AQP2表达水平显著降低,与正常组无差异（P>0.05）;而血浆ALD方面,也只有联合高剂量组表现出显著药效。此结果提示,5-羟甲基糠醛、苍术苷A和鞣质在调控机体水液代谢方面可能具有一定协同作用,且存在剂量依赖关系。2.5焦苍术“健脾止泻”作用机理初步研究2.5.1对肠道菌群结构的影响通过肠道菌群16SrDNA Amplicon测序,根据各细菌科属的相对丰度值比较模型组和各给药组肠道菌群结构的变化。模型组大鼠肠道拟杆菌门（Bacteroidetes）丰度在肠道菌群中所占比例显著降低,而厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）丰度比例明显增加,以拟杆菌属（Bacteroides）和埃希菌属（Escherchia/Shigella）为代表的条件致病菌丰度极显著升高,而代表益生菌的乳杆菌属（Lactobacillus）丰度极显著降低。给药后,5-羟甲基糠醛高剂量组、苍术苷A高剂量组、鞣质高剂量组和联合高剂量组对拟杆菌属和埃希菌属均表现出明显的抑制作用,其中5-羟甲基糠醛高剂量组和联合高剂量组药效最显著,达到与正常组基本无差异;同时,各给药组乳杆菌属丰度值较模型组更低。2.5.2对结肠5-HT及5-HTR表达水平的影响运用ELISA和RT-PCR法检测5-HT及及其受体5-HT4R、5-HT7R表达水平,结果显示,模型大鼠结肠组织5-HT及5-HT4R、5-HT7R均显著高表达（P<0.01）。相较于模型组,各给药组对结肠5-HT及5-HT4R、5-HT7R的过高表达均有显著下调作用（P<0.05）;其中,5-羟甲基糠醛、苍术苷A、鞣质和联合给药高剂量组结肠5-HT含量恢复至与正常组无统计学差异（P>0.05）;5-羟甲基糠醛高剂量组,苍术苷A高剂量组,鞣质低剂量组和联合高、低剂量组5-HT4R表达水平均降低至与正常组无统计学差异（P>0.05）;5-羟甲基糠醛和苍术苷A高剂量组以及联合给药高、低剂量组均恢复至与正常组无统计学差异（P>0.05）。3结论3.1炒焦可增加苍术化学成分的溶出率焦苍术各提取部位浸膏得率均明显高于生苍术,说明炒焦可增加苍术所含化学成分的溶出率。3.2焦苍术正丁醇提取部位是其“健脾止泻”的主要药效部位通过对生、焦苍术各提取部位对脾虚泄泻模型的药效学研究,焦苍术正丁醇部位在增强胃肠动力、促进消化,抑制消化道炎症和促进结肠对粪便水分重吸收等方面明显强于其他提取部位。说明焦苍术正丁醇提取部位是其发挥“健脾止泻”的主要药效部位。3.3 5-羟甲基糠醛、苍术苷A和鞣质是苍术炒焦引起药效改变的主要增量成分由生、焦苍术正丁醇部位的HPLC指纹图谱对比分析,的确存在显著增量的色谱峰。通过对苍术所含主要成分进行含量测定,5-羟甲基糠醛、苍术苷A、鞣质含量在焦苍术中显著增高,且均具有较强的药理活性。3.4 5-羟甲基糠醛、苍术苷A、鞣质协同调控胃肠功能紊乱5-羟甲基糠醛、苍术苷A和鞣质可通过增强胃和小肠动力,抑制肠道过度增殖的条件致病菌,对抗消化道炎症,下调结肠5-HT及其受体5-HT4R、5-HT7R的表达、恢复其正常运动功能,促进结肠和抑制肾脏对水分的重吸收、使机体水液代谢恢复平衡,达到治疗脾虚泄泻证的目的。综上,苍术炒焦后5-羟甲基糠醛、苍术苷A和鞣质含量显著增高,是焦苍术长于“健脾止泻”的主要物质基础,主要通过促进MTL、GAS等胃肠激素分泌促进胃肠蠕动,抑制肠道条件致病菌,对抗消化道炎症,通过抑制脑肠神经递质5-HT及其受体5-HT4R、5-HT7R的过高表达,调节结肠运动,促进模型大鼠结肠AQP3和抑制肾脏AQP2的表达,恢复机体正常的水液代谢通路,发挥“健脾止泻”功效。