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背景与目的:急性髓性白血病(acute myeloid leukemia,AML)是起源于髓系造血干/祖细胞的血液恶性肿瘤,以骨髓与外周血中原始和幼稚的髓性细胞异常增生为主要特征,近年其发病率有逐年增长的趋势。相较于急性淋巴细胞性白血病(acute lymphatic leukemia,ALL)而言,儿童AML的治愈率较低,复发率高,据国内外报道,目前儿童AML的五年生存率为65%左右[1],但仍有20%-60%的病例出现复发。因此,为复发难治性AML寻找新的疗法是亟待解决的问题。目前临床上主要采用化学疗法治疗AML,儿童AML初次完全缓解(complete remission,CR)率均能达到85%以上,对于存在预后不良因素的患儿,可考虑在第2次CR后行异基因造血干细胞移植(Allo-HSCT)。但最终的复发率依然超过30%以上。双特异性抗体(bispecific antibodies,BsAbs)、嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor Modified T cells,CAR T cells)和免疫检测点阻滞剂(Immune Checkpoint Inhibitor,ICI)的问世,开启了免疫疗法的新篇章,AML的治疗进入了新的领域。Blinatumomab是抗CD19/CD3的BiTE,2017年7月被FDA批准用于治疗复发或难治性B细胞急性淋巴细胞性白血病(relapsed or refractory acute lymphoblastic leukemia,R/R ALL),在临床上获得巨大成功。2008-2011 年,一项针对移植后复发/难治性ALL的研究在儿童中展开,共纳入9例,其中4例患者在首次疗程完成后达到CR。在另一项研究中,在接受推荐剂量的70例患者中,27例在前两个疗程内达到CR,其中14例MRD转阴,显示双特异性抗体(bispecific antibodies,BsAbs)具有极大的治疗潜力。然而,目前国际上还未推出高疗效的靶向AML的双特异性抗体。患有AML的部分病人不能彻底治愈的原因主要是不能彻底清除白血病干细胞(leukemia stem cells,LSC)或白血病起始细胞(leukemia initiating cells,LIC)。对于AML来说,目前已知可用于靶向治疗的靶抗原主要有CD33、CD123、CLL-1。靶向CD33、CD123、CLL-1的双特异性抗体已有报道,例如AMG 330是抗CD33/CD3的双特异性抗体,临床前实验显示,每日低至0.002 mg/kg的AMG 330可显著延长接种了人MOLM-13 AML细胞和人T细胞的免疫缺陷小鼠的存活时间。但上述抗体都不足以完全杀灭髓系白血病细胞。Goardon等对74例CD34+AML患者骨髓白血病细胞的基因表达谱及免疫表型研究发现,87.8%的白血病干细胞为CD45RA+;Kersten等分析了 57例CD34+AML患者的骨髓细胞,发现在80.7%的患者骨髓CD34+CD38-干细胞膜上表达CD45RA。上述研究提示,AML-LSC大部分表达CD45RA,因此,CD45RA可能是治疗AML的一个潜在靶点。目前,国内外尚未见到采用CD45RA与CD3耦合的双特异性抗体进行靶向杀伤研究的报道。3A4(专利号:ZL200910246034.8,ZL200910246023.X)为本实验室自行研制的抗人CD45亚类单抗,属鼠IgG1κ亚类,已被第七届国际人类白细胞分化抗原命名大会(HLDA7)命名。该抗体仅识别髓系白血病及其干细胞、B系肿瘤细胞、正常B细胞、CD45RA阳性T细胞、部分单核细胞,而对正常记忆T细胞、嗜中性粒细胞、红细胞、血小板及原始造血干细胞无反应,更为重要的是,该抗体与非造血系统组织器官和细胞不反应,最大限度地减少对非识别组织细胞的毒副作用,具有良好的靶向性。本研究拟构建CD3-3A4 BiTE并探讨其体外靶向杀伤AML及其LSC或LIC的生物学功能,为进一步开发该新型治疗性抗体制剂奠定基础。方法:一、CD3-3A4 BiTE基因真核表达载体的构建及表达(1)设计CD3-3A4 BiTE。查阅资料,检索Pubmed Genebank,并结合实验室已有的成果,确定CD3-3A4 BiTE中CD3与3A4位点的基因序列,并确定铰链区及其大小、各单链可变区的排列顺序。送公司全基因合成SP-CD3VL-3A4VH和3A4VL-CD3VH-6×his两段基因片段,以PUC57质粒载体返回。(2)大量扩增2个目的基因片段。返回的质粒均通过PCR、TA克隆大量扩增,获得 SP-CD3VL-3A4VH 和 3A4VL-CD3VH-6×his 基因片段。(3)构建pcDNA3.1-CD3-3A4 真核表达载体。双酶切 SP-CD3VL-3A4VH(Hind Ⅲ、BamH Ⅰ)、3A4VL-CD3VH-6×his(BamH I、EcoR I)和 pcDNA3.1(Hind Ⅲ、EcoRI),分别纯化后T4连接酶反应过夜。经涂菌、挑克隆、摇菌、测序后,构建成pcDNA3.1-CD3-3A4真核表达载体。(4)转染CHO细胞。抽提pcDNA3.1-CD3-3A4的转染级质粒;使用脂质体法(Roche试剂)转染CHO细胞,24h后加入G418维持至最佳浓度,继续培养获得上清液中的CD3-3A4 BiTE蛋白。二、CD3-3A4 BiTE蛋白的生物学功能鉴定(1)Jurkat细胞、KG1a细胞鉴定。为了便捷检测目的蛋白(CD3-3A4 BiTE)的双特异性识别功能,我们选用Jurkat细胞株作为CD3结合位点的靶细胞,选用AML细胞株KG1a作为3A4结合位点的靶细胞,用荧光直标抗体CD3、CD45RA和流式细胞术分别检测Jurkat细胞和KG1a细胞的抗体反应性。(2)CD3-3A4 BiTE的基因表达、蛋白表达及双功能鉴定。抽提转染后的CHO细胞的RNA,RT-PCR法检测转染后的CHO细胞中pcDNA3.1-CD3-3A4质粒是否表达;一抗 mouse anti-His IgG,二抗 rabbit anti-mouse FITC,免疫荧光法检测转染后的CHO细胞是否表达CD3-3A4 BiTE蛋白;流式细胞术初步检测CD3-3A4 BiTE的CD3和3A4位点是否均具有功能;抗体阻滞实验进一步检测CD3-3A4 BiTE的CD3和3A4位点是否均具有功能。(3)CD3-3A4 BiTE蛋白的纯化及浓度测定。使用蛋白纯化仪纯化CD3-3A4 BiTE蛋白;Westem-Blot检测纯化蛋白的分子大小;BCA法检测纯化蛋白的浓度;流式细胞术检测纯化蛋白的最佳滴定浓度。(4)CD3-3A4 BiTE蛋白的靶向杀伤功能及激活T细胞的能力。CCK-8实验检测CD3-3A4 BiTE的靶向杀伤活性,杀伤KG1a细胞的最佳效靶比及杀伤KG1a细胞的最佳时间比;用流式细胞微球阵列技术(cytometric bead array,CBA)进行细胞因子定量检测法观察T细胞在CD3-3A4 BiTE介导下,靶向杀伤AML细胞株KG1a细胞时的激活情况。结果:一、CD3-3A4 BiTE基因真核表达载体的构建及表达(1)通过查阅资料及实验室已有的成果确定C D 3、3 A4抗体识别位点的基因序列;铰链区选择(G4S)3;单链可变 区的最终排列顺序 为CD3VL-3A4VH-3A4VL-CD3VH。(2)返回的载体经PCR和TA克隆实验后,大量获得SP-CD3VL-3A4VH和3A4VL-CD3VH-6×his 基因片段。(3)SP-CD3VL-3A4VH、3A4VL-CD3VH-6×his 和 pcDNA3.1 经双酶切和纯化后获得带相应酶切位点的片段;T4连接酶反应过夜,经涂菌、挑克隆、摇菌后送测序,对比结果显示pcDNA3.1-CD3-3A4真核表达载体构建成功。(4)使用脂质体法,将转染级质粒PcDNA3.1-CD3-3A4转染进CHO细胞中,24h后G418维持最佳浓度600μg/ml继续大量培养。二、CD3-3A4 BiTE蛋白的功能鉴定(1)Jurkat细胞与CD3抗体的阳性应率为9反2.37%,平均荧光强度(MFI值)为 60.5(FITC),与 CD45RA 的阳性反应率为 7.71%,MFI 值为 5.37(FITC),提示Jurkat细胞是检查CD3结合位点的合适靶细胞。KG1a与CD3抗体的阳性反应率为0.29%,MFI值为4.59(FITC),与CD45RA的阳性反应率为90.69%,MFI值为36.3(FITC),提示KG1a是检查CD45RA结合位点的合适靶细胞。(2)RT-PCR法结果显示CD3VL、CD3VH、3A4VL和3A4VH的条带大小与预期相符,提示转染后的CHO细胞中pcDNA3.1-CD3-3A4质粒已成功转染;免疫荧光法结果显示实验组的GREEN场中有绿色荧光蛋白表达,空载组则无,提示转染后的CHO细胞已成功表达CD3-3A4BiTE蛋白;流式细胞术法结果显示:CD3阳性的Jurkat细胞在与CD3-3A4 BiTE(一抗)和GAMFITC(二抗)反应后结果阳性,3A4 阳性的KG1a细胞在与CD3-3A4BiTE(一抗)和GAM FITC(二抗)反应后结果阳性,提示初步确定CD3-3A4 BiTE的CD3和3A4位点均具有识别功能;抗体阻滞实验结果显示:经CD3单抗阻滞后的Jurkat细胞在与CD3-3A4 BiTE(一抗)和anti-His FITC(二抗)反应后阳性率比起阻滞前大幅降低,经3A4单抗阻滞后的KG1a细胞在与CD3-3A4 BiTE(一抗)和anti-His FITC(二抗)反应后阳性率比起阻滞前显著降低,提示确定CD3-3A4 BiTE的CD3和3A4位点均具有特异性靶向识别功能。(3)通过结合缓冲液和洗脱缓冲液的配合,使用蛋白纯化仪获得纯化蛋白CD3-3A4 BiTE;Western-Blot 结果显示 CD3-3A4 BiTE 蛋白分子量大小约为 55kDa,与设计预期一致;BCA法检测纯化CD3-3A4BiTE蛋白的浓度为50ng/μl;流式细胞术法检测纯化蛋白CD3-3A4BiTE在KG1a细胞密度为1×106个/ml时为10.5μg即10.5μg/106可达到饱和状态。(4)CCK-8实验结果显示:T细胞在CD3-3A4 BiTE的介导下,与3A4 阳性的KG1a细胞反应,不与3A4阴性的293T细胞反应,提示CD3-3A4 BiTE具有靶向性;当CD3-3A4 BiTE饱和时,效靶比设置为1:1、5:1、10:1、25:1和50:1,各组之间差异无统计学意义,提示1:1的效靶比已足够进行有效靶向杀伤作用;孵育时间:效果(时:效)比设为6h、12h、18h、24h、48h、72h时,其杀伤KG1a细胞的均值分别为 4.8%±2.28%、23%±6.71%、50.4%±8.42%、68.1%±7.27%、84.3%±10.68%和79.8%±9.03%(n=5),以48h结果为参照,各组间比较结果如下:6h vs 48h,P<0.01;12h vs 48h,P<0.01;18hvs 48h,P<0.01;48h vs 24h,P=0.04;72h vs 48h,P=0.91,因此,选择48h作为最佳时间比。细胞因子监测实验结果显示:CD3-3A4 BiTE介导T细胞靶向杀伤KG1a细胞时(n=4),IL-2、IL-4和IL-6升高且组内配对t检验差异有统计学意义,而IL-10、TNF-α和IFN-γ组内配对t检验差异无统计学意义。结论:(1)pcDNA3.1-CD3-3A4真核表达载体构建成功;(2)CD3-3A4 BiTE基因成功转染到CHO细胞中进行表达,所表达的目的蛋白具有良好的双特异性靶向结合活性。(3)CD3-3A4 BiTE蛋白能介导活化T细胞基础。靶向杀伤白血病细胞,为进一步开发该制剂进行AML靶向治疗实验奠定了(4)CD3-3A4BiTE靶向杀伤作用的机制,具有激活T细胞的功能。