人FLT3 Ligand基因的克隆、表达与产物纯化

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FLT3配体(FL)是1993年由Lyman等以可溶性FLT3受体为底物先后从鼠和人的细胞系克隆获得其基因。由235个氨基酸组成。开始的26个氨基酸组成信号肽,细胞外区156个氨基酸,跨膜区23个氨基酸以及胞浆区20个氨基酸。广泛分布于人体的各种组织,在外周血单个核细胞中表达水平最高,FL是一种具有促进早期造血功能的细胞因子。在再生障碍性贫血、骨髓抑制等一系列造血功能障碍时,血清FL浓度升高,FL是评价造血功能的可靠指标之一。FL单用或与其它细胞因子联合应用,可以有效地扩增造血干/祖细胞,增加定向造血干/祖细胞及除红系以外的各系列血细胞。FL可有效地激发造血干/祖细胞进入细胞周期,因此,对以造血干/祖细胞为靶细胞的基因治疗具有重要意义。研究发现,由于FL对DC细胞、NK细胞及CTL的刺激作用,其在体内具有显著的抗肿瘤作用。此外,FL还有抗病毒、抗细菌感染的辅助治疗,最新研究表明,FL具有显著的辐射防护作用。 为了大量制备FL,以及探讨FL的生物学活性,首先,分离人外周血单个核细胞,提取总RNA,采用RT-巢式PCR扩增人FLT3配体胞外段基因,以双脱 重回罩区大学习士研丑生论文氧终止法进行DNA序列分析;将测序正确的目的基因克隆入大肠杆菌融合表达载体PRSET-B;重组质粒PRSET-B-FL转化大肠杆菌队(DE3),用IPTG进行诱导后,收集细菌,菌体裂解后,利用常压离子交换色谱的方法对表达蛋白进行纯化,并进行 SDS-PAGE及Western-blot检测. gJ.外周血单核细胞中克隆得到长462hp的巳胞外段基因,测序正确;经 ECORI和 Hjodlll酶切鉴定证实,FL成功地克隆到表达载体 pRSET干;构建的表达载体PRSET-B-FL在大肠杆菌中表达出相对分子量为24kD的融合蛋白,经常压离子交换色谱纯化后的融合蛋白的纯度达3u90x,该融合蛋白具有n抗原持性.成功地克隆并表达了FL基固,并对融合蛋白进行了初步纯化,为九规模获得FL创造了条件.
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